[發(fā)明專利]一種高效的基因工程載體

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810108390.2
• 申請(qǐng)日: 2018-02-02
• 公開（公告）號(hào): CN110129346A
• 公開（公告）日: 2019-08-16
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 姜有為;李云飛
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州菁因康生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N15/63
• 分類號(hào): C12N15/63;C12N1/21;C12N1/19;C12N1/15;C12N15/90
• 代理公司: 上海一平知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31266
• 代理人: 崔佳佳;徐迅

本發(fā)明提供5’到3’分別為T?F?GOI；T?GOI?F；F?T?GOI；F?GOI?T；GOI?T?F；GOI?F?T；F?GOI；GOI?F；或P?F?GOI；P?GOI?F；F?P?GOI；F?GOI?P；GOI?P?F；GOI?F?P；F?GOI；GOI?F所示核苷酸構(gòu)建物，各元件如說明書所述。利用該核苷酸構(gòu)建物可將大量外源基因整合在基因組中，但不破壞整合位點(diǎn)附近的基因功能，不影響宿主細(xì)胞的生存。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域；具體地說，本發(fā)明涉及通過兩次重組而將大量外源基因整合在生物機(jī)體的基因組中，同時(shí)避免破壞宿主細(xì)胞基因功能的新型基因工程載體。

背景技術(shù)

N-糖基化是蛋白翻譯后的一個(gè)重要修飾過程，對(duì)蛋白的結(jié)構(gòu)和功能起著重要的作用。哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母細(xì)胞在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)腔合成新生肽鏈的同時(shí)，對(duì)新生肽鏈進(jìn)行相同的N-糖基化起始步驟及修飾加工過程，首先前體寡糖G1c₃Man₉GlcNAc₂被連接到新生肽鏈Asn-X-Thr/Ser(X為除Pro外的任意氨基酸)保守序列中的Asn殘基上，然后在葡萄糖苷水解酶I、Ⅱ和甘露糖苷水解酶I等糖苷水解酶的作用下，蛋白的糖鏈被加工形成Man₈GlcNAc₂糖鏈結(jié)構(gòu)，隨后帶有該糖鏈的蛋白被轉(zhuǎn)運(yùn)至高爾基體中。但是在哺乳動(dòng)物細(xì)胞和酵母高爾基體內(nèi)，蛋白糖鏈的進(jìn)一步修飾加工過程則完全不同。在哺乳動(dòng)物細(xì)胞高爾基體內(nèi)，蛋白上的Man₈GlcNAc₂糖鏈?zhǔn)紫仍诟事短擒账饷窱(MnsI)的作用下，去除三個(gè)甘露糖，形成Man₅GlcNAc₂糖鏈結(jié)構(gòu)；然后在N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶I(GnTI)的作用下添加一個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖，形成GlcNAcMan₅GlcNAc₂糖鏈結(jié)構(gòu)；然后在甘露糖苷水解酶II(MnsII)的作用下，再去除兩個(gè)甘露糖，形成GlcNAcMan₃GlcNAc₂糖鏈結(jié)構(gòu)；接著在N-乙酰氨基葡萄糖轉(zhuǎn)移酶II(GnTII)的作用下再添加一個(gè)N-乙酰氨基葡萄糖，形成GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂糖鏈結(jié)構(gòu)；最后在半乳糖轉(zhuǎn)移酶(GalT)和唾液酸轉(zhuǎn)移酶(ST)的作用下，加工形成Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂和Sia₂Gal₂GlcNAc₂Man₃GlcNAc₂復(fù)雜型糖鏈結(jié)構(gòu)。但是在酵母細(xì)胞高爾基體內(nèi)，在OCH1基因編碼的α-l,6-甘露糖轉(zhuǎn)移酶(Ochlp)的作用下,蛋白上的Man₈GlcNAc₂糖鏈?zhǔn)紫冉邮芤粋€(gè)α-l,6-甘露糖，形成Man₉GlcNAc₂糖鏈結(jié)構(gòu)，然后在其它各種甘露糖轉(zhuǎn)移酶的作用下繼續(xù)添加甘露糖，形成高甘露糖型的糖鏈結(jié)構(gòu)。因此，用酵母生產(chǎn)蛋白的一個(gè)主要缺陷是對(duì)蛋白N-糖基化修飾形成與人體不同的高甘露糖鏈，它可能改變糖蛋白的結(jié)構(gòu)，影響其功能，具有免疫原性(Kornfeld,R.&Kornfeld,S.Assembly ofasparagine-linked oligosaccharides.Annu.Rev.Biochem.54,631–664,1985)。