[發(fā)明專利]一種脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體、其制備方法及其催化合成克林霉素棕櫚酸酯的方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810108258.1
• 申請(qǐng)日: 2018-02-02
• 公開（公告）號(hào): CN108342433B
• 公開（公告）日: 2020-12-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 王安明;章鵬飛;余建云
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 杭州師范大學(xué)
• 主分類號(hào): C12P19/64
• 分類號(hào): C12P19/64;C12N9/20
• 代理公司: 深圳市合道英聯(lián)專利事務(wù)所(普通合伙) 44309
• 代理人: 謝成毅;廉紅果

1.一種脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體催化合成克林霉素棕櫚酸酯的方法，其特征在于：所述方法以式I所示克林霉素游離堿和式II所示棕櫚酸乙烯酯為底物，在脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體的催化作用下，與DMSO在30～40℃進(jìn)行反應(yīng)24～30h，制得式III所示克林霉素棕櫚酸酯；所述脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體為疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的磷酸鈣晶體；化學(xué)反應(yīng)式如下：

所述方法具體包括以下步驟：

(1)、將克林霉素游離堿、棕櫚酸乙烯酯溶于DMSO中并加入脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體，置于30～40℃搖床中震蕩反應(yīng)24～30h；反應(yīng)結(jié)束后，離心，濾渣用DMSO進(jìn)行洗滌，得到上清；克林霉素游離堿與棕櫚酸乙烯酯的摩爾比為1:1～1:3；

(2)、將步驟(1)得到的上清進(jìn)行加熱減壓旋干；加入二氯甲烷溶解并用HCl調(diào)節(jié)pH值至1～2，接著加熱減壓旋干；加入乙醇溶解并加入乙腈，在0℃下攪拌4h，過(guò)濾，得到純的克林霉素棕櫚酸酯；

所述脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體的具體制備方法如下：

5mL的含有0.25mg/ml疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的磷酸鹽緩沖液中加入濃度為200mM氯化鈣溶液100μL，該混合物在4℃條件下培養(yǎng)24h；之后在10000rpm下離心5分鐘，去除上清，得到白色沉淀；將得到的白色沉淀用去離子水洗三次，即得疏棉狀嗜熱絲孢菌脂肪酶的磷酸鈣酶晶體；所述磷酸鹽緩沖液的濃度為20mM、pH 6.7。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體催化合成克林霉素棕櫚酸酯的方法，其特征在于：所述脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體的用量是以脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體中所含脂肪酶的量計(jì)，脂肪酶的量為100mg～150mg。

3.如權(quán)利要求1所述的一種脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體催化合成克林霉素棕櫚酸酯的方法，其特征在于：每1mL反應(yīng)溶劑加入克林霉素游離堿0.05mmol、棕櫚酸乙烯酯0.05～0.15mmol。

4.如權(quán)利要求1所述的一種脂肪酶-磷酸鈣復(fù)合酶晶體催化合成克林霉素棕櫚酸酯的方法，其特征在于，所述的克林霉素游離堿的制備方法如下：將2.5g的克林霉素鹽酸鹽溶于6mL的去離子水中，混合均勻后緩慢加入濃度為1mol/L的NaOH 6mL并不斷攪拌，之后靜置一段時(shí)間，去上層的水，下層的沉淀在45℃真空干燥箱中干燥一天，得到的白色固體即為克林霉素游離堿。