[發(fā)明專利]一種基于雙水相系統(tǒng)提取體液中胞外囊泡的方法有效
| 申請(qǐng)?zhí)枺?/td> | 201810107478.2 | 申請(qǐng)日： | 2018-02-02 |
| 公開(kāi)（公告）號(hào)： | CN108362535B | 公開(kāi)（公告）日： | 2021-01-15 |
| 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人： | 趙立波;孔關(guān)義;楊玉清;謝琪琪 | 申請(qǐng)（專利權(quán)）人： | 北京恩澤康泰生物科技有限公司 |
| 主分類號(hào)： | C12Q1/24 | 分類號(hào)： | C12Q1/24 |
| 代理公司： | 北京路浩知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11002 | 代理人： | 王文君;陳征 |
| 地址： | 102206 北京市昌平區(qū)中關(guān)村生命科*** | 國(guó)省代碼： | 北京;11 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關(guān)鍵詞： | 一種 基于 雙水相 系統(tǒng) 提取 體液 中胞外囊泡 方法 | ||
本發(fā)明涉及一種基于雙水相系統(tǒng)提取體液中胞外囊泡的方法，包括向體液樣本中加入聚乙二醇和葡聚糖，通過(guò)加入緩沖溶液調(diào)節(jié)體系的pH值為6.4?8.5，充分混合后震蕩，形成白色乳濁液；然后離心，溶液分為上下兩層；分離得到胞外囊泡。本發(fā)明通過(guò)優(yōu)化聚乙二醇/葡聚糖系統(tǒng)的pH值，顯著提高ATPS胞外囊泡提取的效率及產(chǎn)物純度。本發(fā)明使用ATPS法進(jìn)行胞外囊泡提取最大的優(yōu)勢(shì)在于操作快捷簡(jiǎn)便，能夠在15?20分鐘內(nèi)回收體液中約60％的胞外囊泡。
技術(shù)領(lǐng)域
本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種基于雙水相系統(tǒng)提取體液中胞外囊泡的方法。
背景技術(shù)
包括復(fù)雜的真核生物、革蘭氏陰性和陽(yáng)性細(xì)菌、分歧桿菌和真菌在內(nèi)的多數(shù)生 命體都會(huì)分泌胞外囊泡(ExtracellμLar vesicles)。其類型主要包括，外泌體(Exosome, 粒徑50-100nm)、微泡(Microvesicle，粒徑20-1000nm)，以及凋亡小體(Apoptotic blebs，粒徑1000-5000nm)等1,2。在人體中，內(nèi)源性胞外囊泡被證實(shí)在凝血、細(xì)胞 間信號(hào)傳遞以及廢物管理中發(fā)揮作用3。與此同時(shí)，胞外囊泡因?yàn)閮?nèi)含核酸、蛋白 質(zhì)、脂類等多種生物分子，在疾病的診斷和治療方面均具有很大的潛力4。
目前用于體液中胞外囊泡提取和分離的方法主要包括，超速離心法、膜親和捕 獲法、免疫捕獲法、超濾膜法，以及聚合物沉降法等。其中，超速離心法是基于胞 外囊泡與體液中其它組分大小和密度的區(qū)別，借助超速離心機(jī)將其分離出來(lái)，該方 法所需設(shè)備昂貴、操作復(fù)雜、且回收率不高5-7。膜親和捕獲法和免疫捕獲法需要用 到修飾有膜親和分子或者外泌體特異性抗體的固相表面，導(dǎo)致提取成本較高，不適 合體系放大8-11。超濾膜法是基于胞外囊泡粒徑大小的篩選方法，能夠?qū)崿F(xiàn)快速分 離，但是無(wú)法實(shí)現(xiàn)對(duì)胞外囊泡的濃縮，而且胞外囊泡可能在微米或者納米孔徑的超 濾膜所俘獲影響最終的提取效率12,13。聚合物沉降法，是利用如聚乙二醇一類的聚 合物，通過(guò)改變體液中的微環(huán)境，降低胞外囊泡的溶解度，從而使其沉降，該方法 無(wú)需大型設(shè)備，但是因?yàn)槟遗莸某两颠^(guò)程需要孵育一段時(shí)間(0.5小時(shí)-過(guò)夜不等)， 完成一次操作所需時(shí)間依舊很長(zhǎng)14,15。
雙水相系統(tǒng)(Aqueous Two-Phase System，ATPS)是一種液-液分離技術(shù)，在蛋 白質(zhì)、病毒與核酸等生物分子的分離和純化中具有廣闊的應(yīng)用前景16。該方法不僅 具有較高的分離效率，更重要的是能大幅降低操作時(shí)間。目前國(guó)際上采用ATPS方 法來(lái)分離胞外囊泡的工作已有報(bào)道，主要是使用兩種不同的高分子聚合物(聚乙二 醇和葡聚糖)在一定濃度下形成的互不相溶的雙水相體系，讓胞外囊泡在兩相間進(jìn) 行再分配，然后配合低速離心讓聚合物溶液形成上下兩層，胞外囊泡會(huì)富集在位于 下層的葡聚糖中17,18。
然而，除聚合物濃度之外，影響ATPS對(duì)目標(biāo)顆粒或生物大分子再分配效率的 參數(shù)還有包括pH值和溫度16。尤其以血漿為例，其中最主要的幾個(gè)蛋白質(zhì)的含量 及其等電點(diǎn)分為：白蛋白55％，pI 4.7～5.3；球蛋白35％，pI 7.5；纖維蛋白原4％， pI 55～5.8。而胞外囊泡的等電點(diǎn)不低于8 19。有報(bào)道顯示當(dāng)pH值高于生物分子等電 點(diǎn)時(shí)，生物分子在再分配過(guò)程中會(huì)傾向于進(jìn)入聚乙二醇(PEG)相20，反之亦然。
發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是提供一種基于雙水相系統(tǒng)提取體液中胞外囊泡的方法，通過(guò)優(yōu)化聚乙二醇/葡聚糖系統(tǒng)的pH值，顯著提高ATPS胞外囊泡提取的效率及產(chǎn)物純度。
本發(fā)明研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)ATPS水溶液的pH值介于雜質(zhì)蛋白和胞外囊泡之間某個(gè)數(shù) 值的時(shí)候，胞外囊泡的提取效率和純度能進(jìn)一步提高。
本發(fā)明的原理簡(jiǎn)述如下：
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