[發明專利]一種基于雙水相系統提取體液中胞外囊泡的方法

有效

• 申請號: 201810107478.2
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108362535B
• 公開（公告）日: 2021-01-15
• 發明（設計）人: 趙立波;孔關義;楊玉清;謝琪琪
• 申請（專利權）人: 北京恩澤康泰生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/24
• 分類號: C12Q1/24
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;陳征

本發明涉及一種基于雙水相系統提取體液中胞外囊泡的方法，包括向體液樣本中加入聚乙二醇和葡聚糖，通過加入緩沖溶液調節體系的pH值為6.4?8.5，充分混合后震蕩，形成白色乳濁液；然后離心，溶液分為上下兩層；分離得到胞外囊泡。本發明通過優化聚乙二醇/葡聚糖系統的pH值，顯著提高ATPS胞外囊泡提取的效率及產物純度。本發明使用ATPS法進行胞外囊泡提取最大的優勢在于操作快捷簡便，能夠在15?20分鐘內回收體液中約60％的胞外囊泡。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，尤其涉及一種基于雙水相系統提取體液中胞外囊泡的方法。

背景技術

包括復雜的真核生物、革蘭氏陰性和陽性細菌、分歧桿菌和真菌在內的多數生 命體都會分泌胞外囊泡(ExtracellμLar vesicles)。其類型主要包括，外泌體(Exosome, 粒徑50-100nm)、微泡(Microvesicle，粒徑20-1000nm)，以及凋亡小體(Apoptotic blebs，粒徑1000-5000nm)等^1,2。在人體中，內源性胞外囊泡被證實在凝血、細胞 間信號傳遞以及廢物管理中發揮作用³。與此同時，胞外囊泡因為內含核酸、蛋白 質、脂類等多種生物分子，在疾病的診斷和治療方面均具有很大的潛力⁴。

目前用于體液中胞外囊泡提取和分離的方法主要包括，超速離心法、膜親和捕 獲法、免疫捕獲法、超濾膜法，以及聚合物沉降法等。其中，超速離心法是基于胞 外囊泡與體液中其它組分大小和密度的區別，借助超速離心機將其分離出來，該方 法所需設備昂貴、操作復雜、且回收率不高^5-7。膜親和捕獲法和免疫捕獲法需要用 到修飾有膜親和分子或者外泌體特異性抗體的固相表面，導致提取成本較高，不適 合體系放大^8-11。超濾膜法是基于胞外囊泡粒徑大小的篩選方法，能夠實現快速分 離，但是無法實現對胞外囊泡的濃縮，而且胞外囊泡可能在微米或者納米孔徑的超 濾膜所俘獲影響最終的提取效率¹²,¹³。聚合物沉降法，是利用如聚乙二醇一類的聚 合物，通過改變體液中的微環境，降低胞外囊泡的溶解度，從而使其沉降，該方法 無需大型設備，但是因為囊泡的沉降過程需要孵育一段時間(0.5小時-過夜不等)， 完成一次操作所需時間依舊很長¹⁴,¹⁵。

雙水相系統(Aqueous Two-Phase System，ATPS)是一種液-液分離技術，在蛋 白質、病毒與核酸等生物分子的分離和純化中具有廣闊的應用前景¹⁶。該方法不僅 具有較高的分離效率，更重要的是能大幅降低操作時間。目前國際上采用ATPS方 法來分離胞外囊泡的工作已有報道，主要是使用兩種不同的高分子聚合物(聚乙二 醇和葡聚糖)在一定濃度下形成的互不相溶的雙水相體系，讓胞外囊泡在兩相間進 行再分配，然后配合低速離心讓聚合物溶液形成上下兩層，胞外囊泡會富集在位于 下層的葡聚糖中¹⁷,¹⁸。

然而，除聚合物濃度之外，影響ATPS對目標顆?；蛏锎蠓肿釉俜峙湫实?參數還有包括pH值和溫度¹⁶。尤其以血漿為例，其中最主要的幾個蛋白質的含量 及其等電點分為：白蛋白55％，pI 4.7～5.3；球蛋白35％，pI 7.5；纖維蛋白原4％， pI 55～5.8。而胞外囊泡的等電點不低于8 ¹⁹。有報道顯示當pH值高于生物分子等電 點時，生物分子在再分配過程中會傾向于進入聚乙二醇(PEG)相²⁰，反之亦然。

發明內容

本發明目的是提供一種基于雙水相系統提取體液中胞外囊泡的方法，通過優化聚乙二醇/葡聚糖系統的pH值，顯著提高ATPS胞外囊泡提取的效率及產物純度。

本發明研究發現，當ATPS水溶液的pH值介于雜質蛋白和胞外囊泡之間某個數 值的時候，胞外囊泡的提取效率和純度能進一步提高。

本發明的原理簡述如下：