[發明專利]RAGE穩定低表達的宮頸鱗癌CaSki細胞的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201810107245.2
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108251455B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 朱雪瓊;周璐璐;李如意
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學附屬第二醫院;溫州醫科大學附屬育英兒童醫院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 浙江納祺律師事務所 33257
• 代理人: 朱德寶

本發明公開了一種RAGE穩定低表達的宮頸鱗癌CaSki細胞的構建方法及其應用，構建方法主要包括：構建慢病毒干擾質粒pLKO.1?TRC?shRAGE，包裝慢病毒載體，收毒及擴增。本發明的RAGE干擾慢病毒能下調宮頸鱗癌CaSki細胞中RAGE蛋白的表達，抑制CaSki細胞的增殖。

技術領域

本技術涉及一種RAGE穩定低表達的宮頸鱗癌CaSki細胞的構建及其應用

背景技術

宮頸癌是威脅女性健康的惡性腫瘤之一，是全球婦女第三大常見的癌癥，每年約有52萬新發病例。高危型HPV持續感染被認為是宮頸癌從癌前病變發展到宮頸癌的主要原因，其亞型主要為HPV16型和HPV18型，其中HPV16最常見。CaSki系HPV 16、18均陽性，小腸腸系膜轉移的宮頸鱗癌細胞，是宮頸癌研究常用的細胞系。

晚期糖基化終末產物受體(The receptor for advanced-glycation endproducts，RAGE)基因位于人染色體6p21.3上，RAGE蛋白是由404個氨基酸組成的、具有多配體的一種跨膜信號受體蛋白,其完整的結構包括胞內域，胞膜域及胞外域3部分。其中胞外域含有3種免疫球蛋白結構，即為配體結合部位，可與AGEs、高遷移率蛋白B1(highmobility group B1，HMGB1)、S100/鈣粒蛋白和β淀粉樣肽(β-amyloid protein，Aβ)等配體相互作用，激活細胞內相關信號通路，進而引起細胞功能的紊亂，導致疾病的發生發展。近年來研究表明，RAGE參與多種惡性腫瘤的發生發展，如食管癌、口腔鱗癌、喉癌和肝癌等。

本課題組前期研究中，采用免疫組織化學檢測宮頸鱗癌、宮頸上皮內瘤變及慢性宮頸炎組織中RAGE蛋白的表達情況，結果發現RAGE蛋白在鱗癌組織中表達量最高，宮頸上皮內瘤變組織次之，而慢性宮頸炎組織則最低。提示RAGE在宮頸鱗癌的發生發展中起一定作用，但具體機制尚未明確。

目前尚未有現成的宮頸鱗癌CaSki細胞RAGE低表達模型供研究，因此亟待建立合適的RAGE低表達的宮頸鱗癌CaSki細胞模型。

發明內容

本發明的目的在于提供一種RAGE穩定低表達的宮頸鱗癌CaSki細胞，通過慢病毒介導RAGE的低表達，探討RAGE對宮頸鱗癌CaSki細胞增殖的影響，為宮頸癌的治療提供新的思路和依據。

本發明是通過以下技術方案實現的：

本發明公開了一種RAGE穩定低表達的宮頸鱗癌CaSki細胞的構建方法，包括構建慢病毒干擾質粒pLKO.1-TRC-shRAGE，包裝慢病毒載體，收毒及擴增。

具體構建方法的步驟如下：

1.載體及目的基因的信息

(1)慢病毒載體pLKO.1-TRC圖譜如附圖1，U6啟動子驅動RNA聚合酶III轉錄以產生shRNA轉錄物。EcoR I和Age I為酶切位點。該載體含有嘌呤霉素抗性，可用嘌呤霉素篩選。

(2)目的序列如下：

siRNA序列：ggCTggTgTTCCCAATAAg。通過插入發卡結構序列TCAAGAG，AgeI酶切位點序列CCGGT，EcoRI酶切位點序列AATTC，得到目的shRAGE序列如下：

RAGE-AgeI-F:CCGGTAAAAAggCTggTgTTCCCAATAAgTCAAGAGCTTATTgggAACACCAgCC(SEQ ID:NO.1)

RAGE-EcoRI-R:AATTCggCTggTgTTCCCAATAAgTCAAGAGCTTATTgggAACACCAgCCTTTTT(SEQ ID:NO.2)

2.慢病毒載體pLKO.1-TRC用EcoR I和Age I雙酶切，酶切完成后膠回收擴增。