[發明專利]RAGE穩定低表達的宮頸鱗癌CaSki細胞的構建方法及其應用

有效

• 申請號: 201810107245.2
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108251455B
• 公開（公告）日: 2021-02-26
• 發明（設計）人: 朱雪瓊;周璐璐;李如意
• 申請（專利權）人: 溫州醫科大學附屬第二醫院;溫州醫科大學附屬育英兒童醫院
• 主分類號: C12N15/867
• 分類號: C12N15/867;C12N5/10
• 代理公司: 浙江納祺律師事務所 33257
• 代理人: 朱德寶

1.一種 RAGE 穩定低表達的宮頸鱗癌 CaSki 細胞的構建方法，其特征在于，所述構建方法包括構建慢病毒干擾質粒 pLKO.1-TRC-shRAGE，包裝慢病毒載體，收毒及擴增，其中具體構建步驟如下：

（1）目的序列如下：

siRNA 序列：ggCTggTgTTCCCAATAAg，通過插入發卡結構序列 TCAAGAG，AgeI 酶切位點序列 CCGGT，EcoRI 酶切位點序列 AATTC，得到目的shRAGE 序列如下：

RAGE-AgeI-F:CCGGTAAAAAggCTggTgTTCCCAATAAgTCAAGAGCTTATTgggAACACCAgCC

RAGE-EcoRI-R:AATTCggCTggTgTTCCCAATAAgTCAAGAGCTTATTgggAACACCAgCCTTTTT ；

（2）目的單鏈片段經 PCR 儀退火成帶粘性末端的雙鏈片段；

（3）慢病毒載體 pLKO.1-TRC 雙酶切： 將慢病毒載體 pLKO.1-TRC 用 Age I 和 EcoRI 雙酶切，酶切完成后膠回收純化；

（4）將步驟(2)得到的產物和步驟(3)經過雙酶切的載體進行連接、轉化、鑒定，即可得到慢病毒干擾質粒 pLKO.1-TRC-shRAGE；

（5）取慢病毒干擾質粒 pLKO.1-TRC-shRAGE 與兩個慢病毒包裝質粒 psPAX2 和pMD2.G，共轉染 HEK293 細胞得到干擾慢病毒；

（6）將干擾慢病毒轉染宮頸鱗癌 CaSki 細胞，得到 RAGE 穩定低表達的宮頸鱗癌CaSki 細胞。

2.如權利要求 1 所述的 RAGE 穩定低表達的宮頸鱗癌 CaSki 細胞的構建方法，其特征在于，其中步驟（6）干擾慢病毒轉染宮頸鱗癌 CaSki細胞的步驟包括：

a.細胞培養：取宮頸鱗癌 CaSki 細胞接種于培養皿中；待細胞融合度達 40%～60%時，加入終濃度為 8μ g/ml 凝聚胺作用細胞 0.5h；

b.將步驟（5）的干擾慢病毒稀釋 10 倍后感染細胞；感染 24h 后，更換成新的完全培養基；

c.用終濃度為 2μ g/ml 的嘌呤霉素進行篩選，隔天更換含嘌呤霉素的培養液，觀察嘌呤霉素對于未轉染細胞的殺傷效果，篩選 1～2w，篩選后的存活細胞，得到 RAGE 穩定低表達的宮頸鱗癌 CaSki 細胞。

3.RAGE 穩定低表達的宮頸鱗癌 CaSki 細胞，其特征在于，所述宮頸鱗癌 CaSki 細胞采用如權利要求 1 所述的 RAGE 穩定低表達的宮頸鱗癌 CaSki 細胞的構建方法獲得。