[發明專利]新疆多浪羊不同生理時期繁殖相關蛋白的篩選與鑒定方法

有效

• 申請號: 201810106686.0
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108398494B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發明（設計）人: 常衛華;徐輝;王娟紅;錢偉;崔子龍
• 申請（專利權）人: 塔里木大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N27/62;G01N33/68
• 代理公司: 11385 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司
• 代理人: 董芙蓉<國際申請>=<國際公布>=<進入

本發明公開了一種新疆多浪羊不同生理時期繁殖相關蛋白的篩選與鑒定方法，屬于生物技術領域，該方法包括以下步驟：步驟1、新疆多浪羊不同生理時期卵巢的獲得：步驟2、蛋白提取；步驟3、Bradford蛋白定量和標準曲線的繪制；步驟4、樣品標記和等量混合；步驟5、高PH條件下C18色譜柱的HPLC分級；步驟6、質譜分析步驟7、數據處理。本發明通過iTRAQ試劑標記，被標記的肽段進行高效液相色譜HPLC分離及質譜檢測MS，共鑒定出4847個蛋白，其中表達顯著差異的蛋白470個。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體地說，涉及一種新疆多浪羊不同生理時期繁殖相關蛋白的篩選與鑒定方法。

背景技術

多浪羊具有常年發情的優良特性，一年四季均可發情，受長、短日照規律的影響較小，可以按“一年兩胎”或“兩年三胎”繁殖。而大部分品種綿羊為季節性發情，受日照規律的影響較大，一般只在夏秋季節發情，只能按一年一胎進行繁殖。在規模化、集約化養殖趨勢下，最大限度挖掘家畜的繁殖潛力是經濟效益的追求所在，而季節性發情明顯限制了羊繁殖潛能的發揮。從文獻查閱及該領域專家報告來看，目前對綿羊常年發情和季節性發情的分子遺傳機制還不是很清楚，只是對季節性發情的主要生理途徑有個大致了解。無論是非細胞生物的病毒,還是具有細胞結構的原核生物與真核生物,其遺傳物質發揮作用的最終執行者均為蛋白質,蛋白質的功能與活性決定了生物體活動的所有方面。

同位素標記相對和絕對定量(isobaric tags for relative and absolutequantitation,iTRAQ)技術具有非常好的精確性和重復性，在分子生物學領域得到廣泛應用。該技術由美國應用生物系統公司(Applied Biosystems Incorporation,ABI)開發，是一種新的、功能強大的相對和絕對定量研究的方法。iTRAQ試劑由三部分組成：報告基團(4標實驗相對分子質量分別為114、115、116和117；8標實驗相對分子質量分別為113、114、115、116、117、118、119和121)；質量平衡基團(4標實驗相對分子質量分別為31、30、29和28；8標實驗相對分子質量分別為32、31、30、29、28、27、26和24)和肽反應標記試劑基團，形成4種或8種相對分子質量均為145的等量異位標簽。iTRAQ定量方法可以在一次串聯質譜實驗中同時比較4個最多可達8個樣品中的蛋白的相對含量，具有高效率、高精確性等特點。但目前，該技術還沒有應用到多浪羊不同生理時期卵巢相關蛋白的篩選與鑒定。

發明內容

本發明的目的在于彌補現有技術中的空白，提出了一種新疆多浪羊不同生理時期繁殖相關蛋白的篩選與鑒定方法。該方法利用同位素標記相對和絕對定量對新疆多浪羊不同生理時期卵巢蛋白進行鑒定并作GO功能分析、KEGG通路分析及COG分析。

其技術方案如下：

一種新疆多浪羊不同生理時期繁殖相關蛋白的篩選與鑒定方法，包括以下步驟：

步驟1、新疆多浪羊不同生理時期卵巢的獲得：

通過同期發情、發情鑒定和妊娠鑒定技術，將發情間期、發情期和妊娠期多浪羊(塔里木大學動物試驗站飼養)屠宰后立即取出卵巢，并用PBS緩沖液沖洗(PH7.4)組織表面，之后迅速投入液氮進行快速冷凍，并帶回實驗室-80℃保存備用。

步驟2、蛋白提取：

分別取發情間期、發情期和妊娠期多浪羊卵巢取0.1g，加入0.4mL的蛋白裂解液(8.0M脲、50mM NH4HCO3、1×蛋白酶抑制劑)進行超聲破碎，其設置為每次2s，間隔10s，共5min，整個操作在冰上進行。超聲破碎物在冰上放置20min后，4℃，10,000×g，離心30min，取上清轉入新管，然后將蛋白提取液分裝并在-80℃冰箱保存備用。

步驟3、Bradford蛋白定量和標準曲線的繪制