[發明專利]新疆多浪羊不同生理時期繁殖相關蛋白的篩選與鑒定方法

有效

• 申請號: 201810106686.0
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108398494B
• 公開（公告）日: 2019-11-15
• 發明（設計）人: 常衛華;徐輝;王娟紅;錢偉;崔子龍
• 申請（專利權）人: 塔里木大學
• 主分類號: G01N30/02
• 分類號: G01N30/02;G01N27/62;G01N33/68
• 代理公司: 11385 北京方圓嘉禾知識產權代理有限公司
• 代理人: 董芙蓉<國際申請>=<國際公布>=<進入

1.一種新疆多浪羊不同生理時期繁殖相關蛋白的篩選與鑒定方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟1、新疆多浪羊不同生理時期卵巢的獲得：

通過同期發情、發情鑒定和妊娠鑒定技術，將發情間期、發情期和妊娠期多浪羊屠宰后立即取出卵巢，并用PBS緩沖液沖洗PH7.4組織表面，之后迅速投入液氮進行快速冷凍，并帶回實驗室-80℃保存備用；

步驟2、蛋白提取：

分別取發情間期、發情期和妊娠期多浪羊卵巢0.1g，加入0.4mL的蛋白裂解液，所述蛋白裂解液的成分為：8.0M脲、50mM NH4HCO3、1×蛋白酶抑制劑，進行超聲破碎，其設置為每次2s，間隔10s，共5min，整個操作在冰上進行；超聲破碎物在冰上放置20min后，4℃，10,000×g，離心30min，取上清轉入新管，然后將蛋白提取液分裝并在-80℃冰箱保存備用；

步驟3、Bradford蛋白定量和標準曲線的繪制

采用Bradford法對蛋白進行定量，先將已知含量的牛血清白蛋白BSA配成不同濃度的蛋白溶液，分別測定其顯色后的光吸收值OD值，根據OD值與蛋白濃度之間的線性關系，繪制出蛋白濃度的標準曲線，然后測定待測蛋白溶液顯色后的OD值，參照BSA標準曲線計算待測蛋白的濃度；所有操作步驟均在室溫狀態完成；

分別取BSA 8μg、10μg、12μg、14μg、16μg、18μg配成不同濃度的蛋白溶液，并測定吸光值，如果相關性R²<0.95，標準曲線不能用于計算，重新進行實驗；

根據計算配置蛋白溶液，總體積為20μL；同時準備被檢樣本1.0μL，與19μL水混合，加入檢測酶標板，每個樣本檢測2個復孔；每個復孔加入200μL Bradford工作液，輕微吸打混勻；避光，室溫靜止放置15min；用酶標儀檢測，檢測波長設定在595nm；根據標準曲線推導出檢測蛋白的總量，并計算相應濃度；步驟4、樣品標記和等量混合

各組樣品肽段分別取100μg，按照AB公司試劑盒：iTRAQ Reagent-8plex MuLtiplexKit說明書進行標記，標記之后取少量樣本混合，進行LC-MS/MS質譜檢測，查看iTRAQ標記效率；

步驟5、高PH條件下C18色譜柱的HPLC分級

步驟6、質譜分析

毛細管高效液相色譜

每份樣品采用納升流速HPLC液相系統Easy nLC 1000進行分離；緩沖液：A液為0.1％甲酸水溶液，B液為0.1％甲酸乙腈溶液；色譜柱以95％的A液平衡；樣品由自動進樣器上樣到色譜柱C18 trap column，C18 3μm 100μm×2cm，再經分析柱C18 column，C18 3μm75μm×15cm分離，流速為300nl/min；

質譜鑒定

每份樣品經毛細管高效液相色譜分離后用Orbitrap Fusion lumos質譜儀進行質譜分析；

步驟7、數據處理

原始質譜數據

質譜分析原始數據為RAW文件，用軟件用軟件Sequest和Proteome Discoverer進行搜庫定性及定量分析；

數據庫

本次使用數據庫：protein.selected.fasta

搜庫

搜庫時將RAW文件通過Proteome Discoverer提交至Sequest服務器，選擇已經建立好的數據庫，然后進行數據庫搜索。

2.根據權利要求1所述的新疆多浪羊不同生理時期繁殖相關蛋白的篩選與鑒定方法，其特征在于，步驟5具體為：

1)將標記抽干后的樣品用100μl流動相A復溶，渦旋振蕩，14,000g離心20min，吸取上清上樣；

2)準備60個空白1.5ml離心管，依次標記為1-60，用于收集分離得到的組份1-60；

3)流速0.7ml/min；

4)從第五分鐘開始，依次收集每1.5分鐘洗脫物到1-60號離心管中；

5)真空冷凍離心干燥；

6)將干燥后的樣品用5μL 0.5％的FA重溶，并將收集到的60個組分合并成6個組分；

7)將合并后的組分14,000g，離心10min，吸取上清上樣10μL。