[發明專利]一種分離提純蛋清溶菌酶的方法

在審

• 申請號: 201810106401.3
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108118044A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發明（設計）人: 劉冬梅;黃燕燕;周欽育;黃泳堯;林鐘培;林梓茵
• 申請（專利權）人: 華南理工大學
• 主分類號: C12N9/36
• 分類號: C12N9/36
• 代理公司: 廣州市華學知識產權代理有限公司 44245
• 代理人: 宮愛鵬

本發明公開了一種用陽離子交換法結合超濾技術分離提純蛋清溶菌酶的方法，其包括如下步驟：(1)蛋清預處理：蛋清攪拌后過篩網過濾；(2)樹脂預處理；(3)吸附：調節蛋清濾液pH值后加入預處理后的樹脂，攪拌后靜置吸附；(3)洗脫：用NaCl溶液攪拌洗脫，濾出洗脫液，重復洗脫并合并洗脫液；(4)超濾：將洗脫液用超濾離心管超濾除蛋白、脫鹽，得到超濾液；(5)干燥：將超濾液干燥后，即得到所述溶菌酶。所得溶菌酶經過SDS?PAGE電泳測得純度高達96％，比活力大于20000U/mg。本發明工藝簡單，成本較低，制備獲得的溶菌酶純度高、活性高。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，特別涉及一種分離提純溶菌酶的方法。

背景技術

陳艷等人于《生物學雜志》2009年第26卷第2期發表的“溶菌酶的研究進展”中提到溶菌酶是一種堿性蛋白質，廣泛存在于鳥類、家禽的蛋清中和哺乳動物的淚液、唾液、血漿、乳汁、胎盤以及體液、組織細胞內，但在蛋清中的含量最豐富(約占蛋清的3.5％)。它能選擇性地水解肽聚糖中-1，4糖苷鍵，同時不破壞其它組織，且本身無毒無害，因而是一種天然的安全性能很好的殺菌劑、防腐劑，可應用于食品、醫藥和日化等行業的防腐。

目前，溶菌酶的制備方法主要有結晶法、離子交換法、超濾法、聚電解質沉淀法、親和層析法等。陶鳳云等人于《北京聯合大學學報(自然科學版)》2006年第20卷第3期發表的“溶菌酶結晶的研究進展”中提到了以NaCl為沉淀劑，MgCl2溶液為洗脫液，醋酸鈉溶液為緩沖液的靜態膜結晶法。使用該方法操作簡單但生產周期長，原料利用率低，不適合工業化生產。

王煒軍等人于《華南農業大學學報》1996年03期發表的“脫氨再生幾丁質凝膠親和柱層析法純化溶菌酶”一文中首次采取脫氨再生幾丁質凝膠，用新柱層析法提取純化溶菌酶。充分體現親和層析法可快速的實現目的物與其他雜質的分離的優點，但該方法放大困難，回收率低，在粘度大時更易造成層析柱的堵塞，故不適合工業化生產。

余海芬等人于《中國家禽》2008年24期發表的“陽離子交換法提取蛋清溶菌酶的研究”中用陽離子交換樹脂法提取蛋清溶菌酶，采用的硫酸銨洗脫液成本較高，制備的溶菌酶的酶純度和酶比活力不夠高。

以上表明國內對溶菌酶的分離純化、提取制備方法曾經用到結晶法、離子交換層析法、親和層析法等，但都有一定弊端。即便是目前工業生產主要采用陽離子交換法，通過陽離子樹脂吸附、高鹽洗脫、脫鹽脫水和霧化干燥等步驟獲得溶菌酶，但由于溶菌酶洗脫液溶液量大、含鹽量高，常用超濾設備負擔重、超濾膜因長時間工作易受污染，膜的使用壽命受到很大的影響；上述技術所選擇的分離提純方法、洗脫液、超濾離心時機等條件不適宜，造成分離提純的成本高，分離后的溶菌酶純度不高，提取工藝落后使得酶活損失大等問題。

發明內容

本發明的目的是彌補現有技術的不足，提供一種用陽離子交換法結合超濾技術分離提純蛋清溶菌酶的方法。提供一種比活力達20000U/mg，純度高達96％的溶菌酶。本發明工藝簡單，無需復雜設備，可以獲得高純度與高生物活性的溶菌酶，克服現有溶菌酶制備工藝的缺點，可大批量生產。

本發明的目的通過如下技術方案實現：

一種陽離子交換法結合超濾技術分離提純蛋白溶菌酶的方法，包括如下步驟：

(1)蛋清預處理：將蛋清攪拌均勻后，過80～120目濾網得蛋清濾液；

(2)樹脂預處理：取樹脂用蒸餾水洗滌至無明顯雜質并濾干，先用鹽酸溶液浸泡后，再用蒸餾水沖洗得樹脂A；樹脂A在氫氧化鈉溶液浸泡后，用蒸餾水沖洗得樹脂B；其中，樹脂選自724大孔弱酸性陽離子交換樹脂、732型陽離子交換樹脂、D152大孔弱酸性陽離子交換樹脂中的一種；

(3)吸附：往蛋清濾液中加入步驟(2)所得樹脂B，攪拌混勻后靜置吸附，棄去上清液，用蒸餾水洗滌，得樹脂L；