[發明專利]豬A型產氣莢膜梭菌滅活疫苗的快速高效制備方法

有效

• 申請號: 201810105934.X
• 申請日: 2018-02-02
• 公開（公告）號: CN108273051B
• 公開（公告）日: 2019-02-22
• 發明（設計）人: 楊耀光;張俊清;郝俊飛;屈建平;楊耀軍;黃建華;邵春華
• 申請（專利權）人: 鄂爾多斯市旭和畜牧有限責任公司
• 主分類號: A61K39/08
• 分類號: A61K39/08;A61K39/39;A61P31/04
• 代理公司: 北京精金石知識產權代理有限公司 11470
• 代理人: 劉俊玲

1.一種豬A型產氣莢膜梭菌滅活疫苗的快速高效制備方法，其特征在于，步驟為：

(1)病原菌的獲取：挑取A型產氣莢膜梭菌致死病豬的病料，刮取腸道內容物，冷藏或冷凍；

(2)菌種培養：將培養基在高壓鍋內高壓滅菌，待到溫度降低后，把病料倒入高壓鍋內，厭氧培養，傳代3次，其中培養基是純牛奶和葡萄糖的合成培養基；

(3)菌液制備：取步驟(2)中三次傳代的菌液接入肉肝胃膜消化湯培養，培養結束后離心，取上清液；

(4)菌液滅活：向步驟(3)的菌液加入質量分數為0.2％的二乙烯亞胺溶液使其最終質量分數為0.02-0.05％，將混合液在20-30℃震蕩滅活20-24h，后加入β-丙內酯使其終濃度為1g/L，在37℃震蕩滅活2h，加入1mol/L的無菌硫代硫酸鈉溶液，使其終濃度與二乙烯亞胺一致，終止滅活1h，得滅活菌液；

(5)疫苗制備：將滅活菌液與佐劑混合，得滅活疫苗；

其中，滅活菌液與佐劑的體積比為1：(2-4)；

所述佐劑為免疫刺激復合物；所述免疫刺激復合物的制備包括以下步驟：

S1：脂類混合物溶液的配制：將卵磷脂和膽固醇加至20％Mega-10中，使兩者終濃度都為10mg/mL；

S2：皂苷溶液的配制：將QS-21溶解于pH為7.2的PBS溶液中，調整濃度為10-15mg/mL；

S3：免疫刺激復合物制備：將脂類混合物溶液和皂苷溶液按體積比為1:(3-5)充分混合室溫下裂解5-7h；冰浴超聲處理，透析，過0.22μm濾膜除菌后于4℃保存備用。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(1)中，冷藏溫度為2-5℃，冷凍溫度為-20℃。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(2)中，高壓鍋滅菌溫度為110℃，滅菌時間為20min；待到溫度降到80℃后，把病料倒入高壓鍋內，42-45℃高溫厭氧培養4-6h進行傳代。

4.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述步驟(3)中，取步驟(2)中三次傳代的菌液接入肉肝胃膜消化湯37℃培養6-10h，培養結束后在4000-6000r/min離心10-15min，取上清液。

5.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述肉肝胃膜消化湯成分包括：豬胃粘膜、牛肉、牛肝、鹽酸、氫氧化鈉、去離子水、乙醇。

6.根據權利要求4所述的制備方法，其特征在于，所述肉肝胃膜消化湯的制備包括以下步驟：將牛肉、牛肝、豬胃粘膜攪碎，加入蒸餾水、鹽酸和乙醇，混合均勻后冷浸20-24h，緩慢加熱至溫度56±1℃保持22-24h，每1h攪拌一次，去除浮油脂，取消化液煮沸，用2mol/L氫氧化鈉溶液調pH值，絨布過濾，取上清液116℃滅菌30min備用。

7.一種根據權利要求1-6任一制備方法制備得到的豬A型產氣莢膜梭菌滅活疫苗。