[發明專利]一種胎盤間充質干細胞凍干粉的制備方法

在審

• 申請號: 201810102140.8
• 申請日: 2018-02-01
• 公開（公告）號: CN108186682A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 吳金蕓;張炬
• 申請（專利權）人: 伯仕利生物科技發展（鹽城）有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K9/19;A61P37/06;A61P1/00;A61P37/02;A61P17/00;A61P17/18;A61K8/99;A61K8/02;A61Q17/04;A61Q19/08;A61Q19/02;A61Q19/00
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王鑫

本發明利用組織快法制備了胎盤干細胞，并采用超聲波破碎法收集細胞內的細胞因子與上清中的細胞因子混合，在低溫環境下凍干，充分保證了胎盤干細胞因子的濃度及活性。本發明的制備方法所制備的凍干粉有效地保存了人胎盤間充質干細胞中的各種具有生物活性的細胞因子混合物，保存期可延長到2年，有效地解決細胞因子溶液保存期有限這一瓶頸，為人胎盤間充質干細胞細胞因子的產業化應用奠定了基礎。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，涉及一種胎盤間充質干細胞凍干粉的制備方法。

背景技術

間充質干細胞(mesenchymal stem cells，MSCs)是一類具有自我更新、增殖和多向分化潛能的成體干細胞，可刺激組織生長和修復，增強組織的再生能力，影響免疫調節，在細胞治療領域有著極為廣闊的應用前景。MSCs可從骨髓、臍帶血、脂肪、滑膜、胎盤、結締組織等部位獲得。

然而，MSCs在組織中的豐度極低，因此，體外培養是實現MSCs應用價值的必需步驟，研究表明，與新鮮分離的MSCs不同，細胞經體外培養擴增后，其生物學特性會發生很大的變化，并隨著培養時間的延長，細胞分化的能力逐漸喪失，這與體內外細胞所處的環境有關，體內的微環境組成相當復雜，不可能用穩定的溫度、pH值和營養成分這些體外因素所模擬的。如何短時間獲取大量功能狀態良好的MSCs，維持MSCs的原始狀態，及控制MSCs分化方向是當前研究的熱點也是難點。另外，越來越多的證據表明，無論靜脈注射還是局部注射，體外培養的MSCs進入到體內后，只有極少量的細胞生存，而這少數存活的細胞通過分泌大量的小分子物質，例如，細胞因子、生長因子、趨化因子等而發揮作用。

胎盤間充質干細胞是一種多能干細胞，是具有自我復制能力的多潛能細胞。在一定條件下，它可以分化成多種功能細胞像APSC多能細胞。相較于其他干細胞，胎盤間充質干細胞具有來源方便，細胞數量充足，易于分離、培養、擴增和純化，傳代擴增30多代后仍具有干細胞特性。胎盤是目前證實干細胞的最佳來源。

在胚胎發育中來源于中胚層。在機體正常的組織損傷修復過程中，胎盤間充質干細胞一種重要的參與組織再生的細胞庫。在組織損傷引起的特殊信號作用下，胎盤間充質干細胞遷移到受損部位，在局部聚集增殖，依據不同的損傷信號沿著不同途徑分化。胎盤間充質干細胞易于分離擴增，體外倍增能力旺盛，即使擴增1億倍仍能保持其多向分化能力。因此，胎盤間充質干細胞是一種實用的組織修復種子細胞。胎盤干細胞具有免疫調節作用，通過負性免疫調節功能，抑制機體亢進的免疫反應，使機體免疫功能恢復平衡，從而可以用來治療造血干細胞移植之后的免疫排斥反應以及克隆氏病、紅斑狼瘡，硬皮病等自身免疫系統疾病。

干細胞在美容行業應用廣泛。干細胞提取物一般是指干細胞培養液上清液及(或)細胞裂解液，其細胞培養液上清液含有大量的具有多種生物活性的蛋白質、多肽及細胞因子，它們參與細胞結構的維持運動信息交流以及組織修復與再生，具有較好的抗光老化、抗氧化、抗皺、美白肌膚、傷口愈合、細胞修復等功效。因此，隨著干細胞提取物的應用價值越來越受到人們的關注，如何獲得大量的、質量穩定可控的干細胞提取物成為人們致力研究的問題。干細胞上清液可以直接進行涂抹，操作簡便。但是，液態的培養上清在常溫保存時間短，這就阻礙了它的推廣和應用。

發明內容

為解決現有技術存在的問題，本發明的目的在于提供一種胎盤間充質干細胞凍干粉的制備方法。

為實現上述目的及其他相關目的，本發明提供一種胎盤間充質干細胞凍干粉的制備方法，包括以下步驟：

⑴、胎盤干細胞的分離和培養：在無菌條件下，收取健康的胎盤，在GMP實驗室生物安全柜將胎盤剪碎至1.5-2.5mm³大小的組織塊，將其置于T175培養瓶所盛的DMEM-LG細胞培養液中，置37℃，5％CO₂培養箱中培養；每隔2-3天換液，直至胎盤干細胞析出，棄去組織塊；細胞長滿后，記為第一代，用0.28％胰酶進行消化傳代；第二代后改用無抗生素 DMEM-LG培養基，并進行傳代培養；