[發明專利]一種胎盤間充質干細胞凍干粉的制備方法

在審

• 申請號: 201810102140.8
• 申請日: 2018-02-01
• 公開（公告）號: CN108186682A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 吳金蕓;張炬
• 申請（專利權）人: 伯仕利生物科技發展（鹽城）有限公司
• 主分類號: A61K35/28
• 分類號: A61K35/28;A61K9/19;A61P37/06;A61P1/00;A61P37/02;A61P17/00;A61P17/18;A61K8/99;A61K8/02;A61Q17/04;A61Q19/08;A61Q19/02;A61Q19/00
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王鑫

1.一種胎盤間充質干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于：包括以下步驟：

⑴、胎盤干細胞的分離和培養：在無菌條件下，收取健康的胎盤，在GMP實驗室生物安全柜將胎盤剪碎至1.5-2.5mm³大小的組織塊，將其置于T175培養瓶所盛的DMEM-LG細胞培養液中，置37℃，5％CO₂培養箱中培養；每隔2-3天換液，直至胎盤干細胞析出，棄去組織塊；細胞長滿后，記為第一代，用0.28％胰酶進行消化傳代；第二代后改用無抗生素DMEM-LG培養基，并進行傳代培養；

⑵、細胞因子的收集：第三代后，細胞長至90％左右可開始收集細胞因子；將細胞狀態良好的細胞收集起來，進行超聲破碎，使其將細胞內未完全釋放的細胞因子釋放出來；并1500rpm離心10分鐘，去除細胞碎片沉淀；

⑶、干細胞提取物的超低溫凍干：將去除細胞碎片沉淀的胎盤干細胞培養原液加入10％BSA作為賦形劑，充分溶解后，用0.45um的無菌過濾器過濾除菌，并分裝至2ml西林瓶中，每瓶1ml；分裝后將西林瓶置于-80℃超低溫冰箱中進行預凍干，預凍12h后取出，再置于凍干機內冷凍干燥；即得到胎盤間充質干細胞凍干粉。

⑷、凍干前后干細胞因子的活性檢測：配制凍干粉溶媒；利用3T3細胞的增殖曲線，模擬成纖維細胞在細胞因子促進下的生長情況；將3T3培養后，采用胰酶消化，計數后，將細胞鋪至四塊六孔板，每兩塊一組，且每塊四孔，其中每孔1*103個細胞；設定第一組為對照組，在所述對照組中添加步驟⑵中收集的細胞；設定第二組為實驗組，在所述實驗組中添加凍干后用溶媒溶解的細胞因子；分別培養24h、48h、72h、96h后，每板取1孔計數，繪制生長曲線。

2.根據權利要求1所述的胎盤間充質干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于：步驟⑴中所述DMEM-LG細胞培養液中含10％FBS、bFGF 5ng/mL、L-谷氨酰胺2mM、青霉素100U/mL、鏈霉素100μg/mL和兩性霉素B 1μg/mL。

3.根據權利要求1所述的胎盤間充質干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于：步驟⑴中所述無抗生素DMEM-LG培養基含10％FBS、bFGF 5ng/mL、L-谷氨酰胺2mM。

4.根據權利要求1所述的胎盤間充質干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于：步驟⑶中所述凍干機為真空冷凍干燥機。

5.根據權利要求1所述的胎盤間充質干細胞凍干粉的制備方法，其特征在于：步驟⑷中所述凍干粉溶媒為2％透明質酸、10％甘油及雙蒸水。