[發明專利]基于MGB探針的石貂毛皮制品的檢測方法

在審

• 申請號: 201810099726.3
• 申請日: 2018-02-01
• 公開（公告）號: CN110106254A
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 白素英;徐琳雅;張偉;劉微;張宇
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明公開了一種基于MGB探針的qPCR法進行石貂毛皮制品真偽的檢測方法，包括石貂上游引物：MfF；石貂下游引物：MfR；石貂探針：MfP；檢測方法：提取樣品的DNA；對樣品DNA進行qPCR擴增；對擴增曲線分析后判定結果。通過特異性實驗、靈敏度實驗、重復性實驗和盲測實驗表明，本發明特異性好、靈敏度高，不需要進行普通PCR產物的后續分析，節約成本，縮短了檢測周期，提高了檢測效率。

技術領域

本發明屬于分子物種鑒定技術領域，具體涉及一種基于MGB探針的實時熒光定量PCR檢測石貂毛皮制品真偽的方法。

背景技術

石貂皮堅韌輕薄，毛被豐厚、絨毛細軟，是毛皮中珍貴的高級制襲原料皮。石貂列入中國《國家重點保護野生動物名錄》，為二級保護動物。

由于貂皮市場巨大，利潤豐厚，因此不乏許多不法商家以其他相似皮毛來冒充名貴貂皮或珍稀貂皮。同時，隨著皮毛加工鞣質的技術越來越成熟，加工工序越來越復雜，傳統的毛皮鑒定方法如宏觀觀察法、掃描電鏡法、DNA測序等已經不能滿足目前的皮毛鑒定的需求，因此也無法準確對毛皮制品進行物種鑒定。

實時熒光定量PCR(Quantitative Real-time PCR)是一種在DNA擴增反應中，加入熒光基團，利用熒光信號積累實時監測整個PCR進程。探針法是qPCR中的一種常見方法，在反應體系中加入化學修飾的寡聚核苷酸探針。探針完整時，報告基團發射的熒光信號被淬滅基團吸收，無法檢測到熒光信號。而當PCR擴增時，Taq DNA酶的5’-3’端外切酶活性將探針酶切降解，使報告熒光基團和淬滅熒光基團分離，熒光報告基團和淬滅基團間的能量傳遞結構被破壞，從而熒光檢測系統可接收到熒光信號，即每擴增一條DNA鏈，就有一個熒光分子形成，實現了熒光信號的累積與PCR產物的形成完全同步。MGB探針是在傳統Taqman探針基礎上改進，通過在探針3’端加入MGB基團，提高探針的退火溫度，縮短探針的長度，提高了探針的特異性和靈敏度。

本發明建立了一種針對石貂毛皮制品的實時熒光定量PCR檢測方法，利用MGB探針，能夠高效、準確和快速的檢測石貂毛皮制品的真偽，同時能對以其他皮毛制品充當石貂皮毛制品的現象進行分析鑒定。線粒體Cytb基因是目前國內外廣泛認可的用于動物物種鑒定的基因，本發明針對Cytb基因設計引物和MGB探針。

發明內容

本發明的第一個目的是設計針對石貂的特異性引物和探針。

本發明的第二個目的是為了克服現有分子生物學檢測技術的不足之處，建立一種使用方便、快捷、準確的貂皮制品真偽的檢測方法。

為了達到上述目的，本發明采用以下方案：

1、DNA的提取體系

取石貂針毛10根(平均3～4cm)或絨毛5mg置于2ml離心管中，剪碎，加入280μlTNE、30μl SDS、20μl DTT、20μl蛋白酶K，加入150μl Buffer C-L(AXYGEN動物基因組提取試劑盒)，立即渦旋振蕩1min混合均勻。瞬時離心后，將離心管置于56℃水浴中過夜消化處理。離心步驟參照AXYGEN動物基因組提取試劑盒說明書進行，加入350μl蛋白去除液，渦旋振蕩30s均勻混合，12000r/min離心10min。將DNA制備管置于2ml離心管中，將離心后的上清移至制備管中，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入500μl洗滌液，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入700μl去鹽液，12000r/min離心1min。棄濾液，重復一次去鹽過程。棄濾液，離心1min。將DNA制備管轉移到新1.5ml離心管中，加入65℃預熱的Eluent洗脫液80μl洗脫、制備DNA，-20℃冷凍備用。

2、引物和探針的設計