[發明專利]基于MGB探針的石貂毛皮制品的檢測方法

在審

• 申請號: 201810099726.3
• 申請日: 2018-02-01
• 公開（公告）號: CN110106254A
• 公開（公告）日: 2019-08-09
• 發明（設計）人: 白素英;徐琳雅;張偉;劉微;張宇
• 申請（專利權）人: 東北林業大學
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/6851
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

1.一種利用MGB探針qPCR法對石貂毛皮制品進行真偽鑒定的方法，其特征在于包括特異性引物和探針的序列如下：

石貂上游引物MfF：5’—TCCTTACCTTGACCTGAATTGGA—3’

石貂下游引物MfR：5’—CAGTTGGCCGATGGTGATAA—3’

石貂探針MfP：5’—(VIC)CCCGTAGAGCACCC(MGB)—3’

2.根據權利1所述的利用MGB探針法qPCR檢測貂皮制品是否為石貂的方法，其特征在于構建20μl熒光反應體系，由以下組分組成：FastStart Universa Probe Master(Rox)10μl，上、下游引物各0.5μl，MGB探針0.5μl，DNA模板7μl，ddH₂O 1.5μl。qPCR反應程序如下：95℃10min；95℃10s，60℃30s，50個循環；60℃1min，循環在退火時收集熒光信號。

3.一種采用如權利1、權利2所述的利用TaqMan-MGB探針法qPCR檢測貂皮制品是否為石貂的方法，其特征在于包括以下步驟：

A、提取樣品DNA。

B、對步驟A中的樣品DNA進行qPCR擴增，其中反應體系由以下組分組成：

所述的引物和探針：

石貂上游引物MfF：5’—TCCTTACCTTGACCTGAATTGGA—3’

石貂下游引物MfR：5’—CAGTTGGCCGATGGTGATAA—3’

石貂探針MfP：5’—(VIC)CCCGTAGAGCACCC(MGB)—3’

C、對擴增后的曲線情況進行結果判定，按照以下判定原則：

Ct值小于等于35并有明顯擴增曲線判為陽性；Ct值大于等于40判為陰性；Ct值介于35～40之間判為可疑，DNA模板加倍重復實驗，如果Ct值減小并擁有明顯擴增曲線判為陽性，否則判為陰性。

4.根據權利3所述的檢測方法，其特征在于步驟B所述的qPCR擴增按照以下步驟進行：

95℃10min；95℃10s，60℃30s，50個循環；60℃1min。循環在退火時收集熒光信號。

5.根據權利3所述的檢測方法，其特征在于步驟A所述的樣品DNA提取按照以下步驟進行：

取石貂針毛10根(平均3～4cm)或絨毛5mg放置于2ml離心管中，剪碎，加入280μl TNE、30μl SDS、20μl DTT、20μl蛋白酶K，加入150μl Buffer C-L(AXYGEN試劑盒)，立即渦旋振蕩1min混合均勻。瞬時離心后，將離心管置于56℃水浴中過夜消化處理。離心步驟參照AXYGEN動物基因組提取試劑盒說明書進行，加入350μl蛋白去除液，渦旋振蕩30s均勻混合，12000r/min離心10min。將DNA制備管置于2ml離心管中，將離心后的上清移至制備管中，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入500μl洗滌液，12000r/min離心1min。棄掉濾液，加入700μl去鹽液，12000r/min離心1min。棄濾液，重復一次去鹽過程。棄濾液，離心1min。將DNA制備管轉移到新的1.5ml離心管中，加入65℃預熱的Eluent洗脫液80μl洗脫、制備DNA，-20℃冷凍備用。