[發(fā)明專利]一種用于檢測松材線蟲的等溫擴(kuò)增試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810097932.0
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108118087A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 石超;王熊;李榮貴;耿以龍
• 申請（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 青島清泰聯(lián)信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37256
• 代理人: 高洋

本發(fā)明提出一種用于檢測松材線蟲的等溫擴(kuò)增試劑盒及其檢測方法，屬于松材線蟲檢測領(lǐng)域，能在一個小時內(nèi)完成松材線蟲核酸的提取、擴(kuò)增、顯色檢測，在檢測到單條松材線蟲的同時有效區(qū)分松材線蟲和擬松材線蟲。該用于檢測松材線蟲的等溫擴(kuò)增試劑盒包括SEA擴(kuò)增引物、2×SEA reaction Mix和10×SEA比色染料，其中，所述SEA擴(kuò)增引物包括如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。本發(fā)明能夠應(yīng)用于松材線蟲的快速檢測中。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于松材線蟲的檢測領(lǐng)域，尤其涉及一種用于檢測松材線蟲的等溫擴(kuò)增試劑盒及其檢測方法。

背景技術(shù)

松材線蟲(Bursaphe lenchus xylophilus)引起的松樹萎蔫病是松林主要的病害之一，1982年，松材線蟲病傳入我國，僅短短的30多年，疫區(qū)范圍擴(kuò)大到江蘇、浙江、安徽、福建、江西、山東、湖北、湖南、廣東、廣西、四川、重慶、貴州、云南等17個省區(qū)市，造成經(jīng)濟(jì)損失上千億元，嚴(yán)重威脅著我國松林生態(tài)系統(tǒng)和經(jīng)濟(jì)財產(chǎn)安全，因此，建立一種靈敏、快速、簡便的松材線蟲檢測方法對松材線蟲的防治極為重要。

因病原體松材線蟲與低致病性的擬松材線蟲及其近緣種之間在形態(tài)學(xué)上很難區(qū)分，用形態(tài)學(xué)方法上容易造成誤判、漏判，所以形態(tài)學(xué)鑒定的方法逐漸被淘汰。近年來，隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，特異性引物PCR、實(shí)時熒光定量PCR等分子診斷方法被應(yīng)用到松材線蟲的檢測上，提高了松材線蟲檢測的準(zhǔn)確性。但依然存在很多缺點(diǎn)，如耗時長、操作繁瑣、需要昂貴的熱循環(huán)儀器，而且很多需要開蓋檢測容易造成污染，需要在專門的實(shí)驗(yàn)室中操作。因此建立一種快速、簡單、無污染，可快速檢測線蟲的技術(shù)意義重大。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提出一種用于檢測松材線蟲的等溫擴(kuò)增試劑盒及其檢測方法，該等溫擴(kuò)增試劑盒具有靈敏度高、特異性好、操作簡單、耗時短等特點(diǎn)，能夠在一個小時內(nèi)完成松材線蟲核酸的提取、擴(kuò)增、顯色等檢測，為松材線蟲的快速檢測提供一種實(shí)際可行的方法。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的一方面提供了一種用于檢測松材線蟲的等溫擴(kuò)增試劑盒，包括SEA擴(kuò)增引物、2×SEA reaction Mix和10×SEA比色染料，其中，所述SEA擴(kuò)增引物包括如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。

本發(fā)明的另一方面提供了一種檢測松材線蟲的方法，包括以下步驟：

1)采用熱裂解法從待檢測樣品中提取松材線蟲基因組DNA；

2)以提取的含有松材線蟲基因組DNA的裂解液作為擴(kuò)增模板，加入如權(quán)利要求1所述的等溫擴(kuò)增試劑盒中的組分建立SEA反應(yīng)體系并進(jìn)行等溫擴(kuò)增；

3)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色變化，判斷待檢測樣品中是否存在松材線蟲。

作為優(yōu)選，步驟1)具體為：

取松材線蟲懸浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl 2×-8×標(biāo)準(zhǔn)濃度WLB液,并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除劑，最后在80-99℃處理2-20min，得到松材線蟲的裂解液作為擴(kuò)增模板。

作為優(yōu)選，步驟1)具體為：

取松材線蟲懸浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl WLB液,并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除劑，最后在95℃處理5min，得到松材線蟲的裂解液作為擴(kuò)增模板。

作為優(yōu)選，所述SEA反應(yīng)體系以恒定62-66℃的溫度反應(yīng)40-60分鐘。

作為優(yōu)選，所述SEA反應(yīng)體系以恒定63℃的溫度反應(yīng)50分鐘。