[發(fā)明專利]一種用于檢測松材線蟲的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒及其檢測方法

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810097932.0
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108118087A
• 公開（公告）日: 2018-06-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 石超;王熊;李榮貴;耿以龍
• 申請（專利權(quán)）人: 青島大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6844
• 分類號: C12Q1/6844
• 代理公司: 青島清泰聯(lián)信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37256
• 代理人: 高洋

1.一種用于檢測松材線蟲的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒，其特征在于，包括SEA擴(kuò)增引物、2×SEAreaction Mix和10×SEA比色染料，其中，所述SEA擴(kuò)增引物包括如SEQ ID No.1所示的上游引物和如SEQ ID No.2所示的下游引物。

2.一種檢測松材線蟲的方法，其特征在于，包括以下步驟：

1)采用熱裂解法從待檢測樣品中提取松材線蟲基因組DNA；

2)以提取的含有松材線蟲基因組DNA的裂解液作為擴(kuò)增模板，加入如權(quán)利要求1所述的等溫?cái)U(kuò)增試劑盒中的組分建立SEA反應(yīng)體系并進(jìn)行等溫?cái)U(kuò)增；

3)根據(jù)擴(kuò)增產(chǎn)物的顏色變化，判斷待檢測樣品中是否存在松材線蟲。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟1)具體為：

取松材線蟲懸浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl 2×-8×標(biāo)準(zhǔn)濃度WLB液,并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除劑，最后在80-99℃處理2-20min，得到松材線蟲的裂解液作為擴(kuò)增模板。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，步驟1)具體為：

取松材線蟲懸浮液4.5μl加入到0.5ml的Eppendorf管中，然后加入5μl2×標(biāo)準(zhǔn)濃度WLB液,并向管中加入0.5μl的20×液相RNase去除劑，最后在95℃處理5min，得到松材線蟲的裂解液作為擴(kuò)增模板。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述SEA反應(yīng)體系以恒定62-66℃的溫度反應(yīng)40-60分鐘。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的方法，其特征在于，所述SEA反應(yīng)體系以恒定63℃的溫度反應(yīng)50分鐘。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的方法，其特征在于，所述WLB液包含125mmol/L KCI、25mmol/LTirs-Cl、3.75mmol/L MgCl₂、2.5mmol/L DTT和質(zhì)量分?jǐn)?shù)1.125％的Tween 20。

8.根據(jù)權(quán)利要求2所述的方法，其特征在于，步驟2)中等溫?cái)U(kuò)增具體為：取5μL 2×SEAreaction Mix、1μl 10×SEA比色染料、1.5μl 10μM上游引物和1.5μl 10μM下游引物、1μl擴(kuò)增模板，然后進(jìn)行實(shí)時熒光擴(kuò)增。

9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，所述實(shí)時熒光擴(kuò)增的檢測條件為：熒光掃描間隔為1min，激發(fā)波長為497nm，檢測波長為520nm。

10.根據(jù)權(quán)利要求2-9任一項(xiàng)所述的方法，其特征在于，所述方法可檢測到松材線蟲的單一線蟲，且松材線蟲基因組DNA的檢出限為最多400fg。