[發明專利]一種單克隆抗體結合單精子冷凍載體及冷凍解凍方法

有效

• 申請號: 201810097734.4
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108287099B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發明（設計）人: 周高見;許東;湯樂;朱文兵;邢柳
• 申請（專利權）人: 周高見;許東;湯樂
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N1/42;G01N1/44;G01N1/34;G01N33/577;G01N33/531
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本發明涉及精子冷凍的技術領域，具體涉及一種單克隆抗體結合單精子冷凍載體及冷凍解凍方法。本發明首先利用APTES使玻片外表面變成羰基，而羰基非常容易和抗體蛋白表面的氨基反應，再利用某些有具有一定特質的單克隆抗體與精子表面特異性結合，抗體的粘附力將精子固定與玻片表面。本發明提供了一種可將單個或多個精子固定于載體表面的方法，可以防止精子在儲存、運輸、操作過程中丟失。

技術領域

本發明涉及精子冷凍的技術領域，具體涉及一種單克隆抗體結合單精子冷凍載體及冷凍解凍方法。

背景技術

在臨床的男性不育患者中，有部分生精功能障礙的患者在取精過程中僅可獲得極少量的精子，只有通過多次取精并冷凍精子才能滿足患者的生育要求。冷凍的損傷會造成部分精子的損失，而現有精子冷凍技術主要針對大量精子冷凍，會造成部分精子的丟失。對于生精功能障礙而需要冷凍精子的患者來說，丟失的這部分精子則可能是致命的。因此需要開發一種不會丟失精子的冷凍技術。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明提供一種單克隆抗體結合單精子冷凍載體及冷凍解凍方法，目的是通過將單個或數個精子固定于載體表面，從而防止精子在儲存、運輸、操作過程中丟失，同時，保障精子的授精能力及遺傳物質不會改變，操作中由于液滴分層而精子在液滴中游動造成的顯微操作中尋找精子困難的問題一并得到解決。

本發明的單克隆抗體結合單精子冷凍載體，所述的單克隆抗體具有抗原結合位點為精子表現錨定蛋白；在精子轉化成熟、獲能過程中不脫離精子表面；抗原抗體結合穩定，抗原抗體結合力可穩定吸附精子；精漿內無該單克隆抗體的抗原存在；單克隆抗體和精子的結合方式是單克隆抗體結合位點與該抗原決定簇特異性結合形成抗原抗體復合體，對抗原形成一定的吸附力，單克隆抗體與精子的體積比例為(10～1000)：1，形成抗體精子溶液。

所述的單克隆抗體為ACRV1acrosomal vesicle protein 1[Homo sapiens(human)]、PH-20[Homo sapiens]；該單抗生產廠家為sant cruz，貨號sc5163。

本發明的單克隆抗體結合單精子冷凍載體的冷凍解凍方法，按照以下步驟進行：

(1)玻片處理：將玻片逐片加入到piranha溶液中用浸泡15-240min(最優時間15min)，然后再放入純水中超聲，至少換水三次以去除玻片表面的有機物，玻片放在80-150℃(最優溫度105℃)干燥箱中干燥15-240min(最優時間30min)，備用；

(2)將3-氨丙基三乙氧基硅烷(APTES)溶到無水乙醇中，其質量比為1％-10％(最優比例2.5％)，將上述烘干的玻片浸到該液體中浸泡12-72小時(最優時間24小時)；此過程可以將玻片表面進行的基團-OH轉換成-NH₃

(3)將玻片用無水乙醇沖洗1-5次(最優3次)后，浸泡在5％戊二醛水溶液中1小時，浸泡結束后用大量的超純水沖洗；

(4)將處理的玻片浸泡在濃度為0.5-0.001mg/ml(最優濃度0.1mg/ml)，溫度為35℃-40℃(最優溫度37℃)的精子抗體溶液中10min-24h(最優時間1小時)；

(5)用顯微受精針取單個或多個精子，添加在玻片表面滴加的精子冷凍保護劑中，固定5-240min(最優時間10min)；

(6)將玻片裝入冷凍試管中，置于液氮平面上1-10cm(最優距離2cm)；1-120min(最優時間5min)后，置于液氮內冷凍；

(7)解凍：在冷凍試管中取出載體玻片，迅速插入用操作皿盛放的已經平衡至35℃-40℃(最優溫度37℃)的礦物油中，一起置35℃-40℃(最優溫度37℃)培養箱中復溫5-240min(最優時間10min)。