[發(fā)明專利]一種單克隆抗體結(jié)合單精子冷凍載體及冷凍解凍方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810097734.4
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108287099B
• 公開（公告）日: 2021-02-09
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 周高見;許東;湯樂;朱文兵;邢柳
• 申請（專利權(quán)）人: 周高見;許東;湯樂
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30;G01N1/42;G01N1/44;G01N1/34;G01N33/577;G01N33/531
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1.一種單克隆抗體結(jié)合單精子冷凍載體的冷凍解凍方法，所述的單克隆抗體具有抗原結(jié)合位點(diǎn)為精子表現(xiàn)錨定蛋白；在精子轉(zhuǎn)化成熟、獲能過程中不脫離精子表面；抗原抗體結(jié)合穩(wěn)定，抗原抗體結(jié)合力可穩(wěn)定吸附精子；精漿內(nèi)無該單克隆抗體的抗原存在；單克隆抗體和精子的結(jié)合方式是單克隆抗體結(jié)合位點(diǎn)與該抗原決定簇特異性結(jié)合形成抗原抗體復(fù)合體，對抗原形成一定的吸附力，單克隆抗體與精子的體積比例為(10～1000)：1，形成抗體精子溶液，其特征在于按照以下步驟進(jìn)行：

(1)玻片處理：將玻片逐片加入到piranha溶液中用浸泡15-240min，然后再放入純水中超聲，至少換水三次以去除玻片表面的有機(jī)物，玻片放在80-150℃干燥箱中干燥15-240min，備用；

(2)將3-氨丙基三乙氧基硅烷溶到無水乙醇中，其質(zhì)量比為1％-10％，將上述干燥的玻片浸到3-氨丙基三乙氧基硅烷溶到無水乙醇中的液體中浸泡12-72小時(shí)；此過程將玻片表面進(jìn)行的基團(tuán)-OH轉(zhuǎn)換成-NH3；

(3)將玻片用無水乙醇沖洗1-5次后，浸泡在5％戊二醛水溶液中1小時(shí)，浸泡結(jié)束后用大量的超純水沖洗；

(4)將處理的玻片浸泡在濃度為0.5-0.001mg/ml，溫度為35℃-40℃的精子抗體溶液中10min-24h；

(5)用顯微受精針取單個(gè)或多個(gè)精子，添加在玻片表面滴加的精子冷凍保護(hù)劑中，固定5-240min；

(6)將玻片裝入冷凍試管中，置于液氮平面上1-10cm；1-120min后，置于液氮內(nèi)冷凍；

(7)解凍：在冷凍試管中取出載體玻片，迅速插入用操作皿盛放的已經(jīng)平衡至35℃-40℃的礦物油中，一起置35℃-40℃培養(yǎng)箱中復(fù)溫5-240min。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體結(jié)合單精子冷凍載體的冷凍解凍方法，其特征在于所述的步驟(1)中玻片逐片加入到piranha溶液中用浸泡15min，然后再放入純水中超聲，至少換水三次以去除玻片表面的有機(jī)物，玻片放在105℃干燥箱中干燥30min，備用。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體結(jié)合單精子冷凍載體的冷凍解凍方法，其特征在于所述的步驟(2)中將3-氨丙基三乙氧基硅烷溶到無水乙醇中，其質(zhì)量比為2.5％，將上述干燥的玻片浸到3-氨丙基三乙氧基硅烷溶到無水乙醇中的液體中浸泡24小時(shí)。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體結(jié)合單精子冷凍載體的冷凍解凍方法，其特征在于所述的步驟(3)中將玻片用無水乙醇沖洗3次后，浸泡在5％戊二醛水溶液中1小時(shí)，浸泡結(jié)束后用大量的超純水沖洗。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體結(jié)合單精子冷凍載體的冷凍解凍方法，其特征在于所述的步驟(4)中將處理的玻片浸泡在濃度為0.1mg/ml，溫度為37℃的精子抗體溶液中1小時(shí)。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體結(jié)合單精子冷凍載體的冷凍解凍方法，其特征在于所述的步驟(5)中用顯微受精針取單個(gè)或多個(gè)精子，添加在玻片表面滴加的精子冷凍保護(hù)劑中，固定10min。

7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體結(jié)合單精子冷凍載體的冷凍解凍方法，其特征在于所述的步驟(6)中將玻片裝入冷凍試管中，置于液氮平面上2cm；5min后，置于液氮內(nèi)冷凍。

8.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單克隆抗體結(jié)合單精子冷凍載體的冷凍解凍方法，其特征在于所述的步驟(7)中在冷凍試管中取出載體玻片，迅速插入用操作皿盛放的已經(jīng)平衡至37℃的礦物油中，一起置37℃培養(yǎng)箱中復(fù)溫10min。