[發(fā)明專利]一種飽和脂肪酸特異性脂肪酶突變體及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810095366.X
• 申請(qǐng)日: 2018-01-31
• 公開（公告）號(hào): CN108034647B
• 公開（公告）日: 2020-08-04
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 喻曉蔚;徐巖
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 江南大學(xué)
• 主分類號(hào): C12N9/20
• 分類號(hào): C12N9/20;C12N15/55
• 代理公司: 哈爾濱市陽(yáng)光惠遠(yuǎn)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 23211
• 代理人: 張勇

本發(fā)明公開了一種飽和脂肪酸特異性脂肪酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。本發(fā)明根據(jù)華根霉脂肪酶(RCL)結(jié)構(gòu)分析，對(duì)其進(jìn)行定點(diǎn)突變，獲得了脂肪酸特異性改變的突變酶。比較野生型脂肪酶與突變酶催化水解動(dòng)物油的能力，得到了水解率遠(yuǎn)高于野生型脂肪酶的突變酶。相比野生型RCL，突變酶T286Q、I281F和A116W/I281F由于增強(qiáng)了對(duì)飽和脂肪酸的特異性，其對(duì)豬油水解率分別由55％提高到了85％、90％和86％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種飽和脂肪酸特異性脂肪酶突變體及其應(yīng)用，屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

脂肪酸是油脂化工中最基礎(chǔ)，使用最為廣泛的原料之一。天然油脂水解是獲得游離脂肪酸的重要途徑之一。脂肪酸的生產(chǎn)技術(shù)主要有皂化法、水解法、蒸汽裂解法以及酶水解法，其中酶水解法由于具有反應(yīng)條件溫和、不飽和脂肪酸不易被氧化、副產(chǎn)物少的優(yōu)勢(shì)，成為脂肪酸制取方法的研究熱點(diǎn)。不同類型、不同碳鏈長(zhǎng)度及不同比例的脂肪酸具有不同的功能。短鏈脂肪酸可作為飼料添加劑，促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)。中鏈脂肪酸廣泛應(yīng)用于醫(yī)藥、保健食用油及養(yǎng)殖業(yè)。長(zhǎng)鏈不飽和脂肪酸在代謝中具有廣泛的生理活性，用于健康保健。植物油脂中不飽和脂肪酸含量較高，如大豆油、菜籽油和油茶油中不飽和脂肪酸含量分別為84.34％、77.70％和81.43％。長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸如棕櫚酸和硬脂酸，廣泛存在于豬、牛和羊等動(dòng)物油中，主要用于生產(chǎn)作為乳化劑的脂肪酸鹽，并作為常用的塑料制品的穩(wěn)定劑。動(dòng)物油中各類飽和脂肪酸質(zhì)量分?jǐn)?shù)之和通常在60％以上，而且脂肪酸鏈長(zhǎng)多為十六碳、十八碳，合計(jì)可達(dá)90％以上，含有十六個(gè)及十八個(gè)碳原子的脂肪酸經(jīng)甲酯化后得到的甲酯產(chǎn)品與礦石柴油具有相近的碳原子數(shù)，同時(shí)在很多理化性質(zhì)上都有相似性，因此可以利用動(dòng)物油水解制備脂肪酸作為生物柴油的合成原料。

脂肪酶(Triacylglycerol hydrolase，Lipase，EC 3.1.1.3)是一類甘油三酯水解酶，在油水界面催化酯鍵的水解或者合成，是“綠色”油脂加工制造的重要工業(yè)酶。動(dòng)物油是制備長(zhǎng)鏈飽和脂肪酸的重要來源，但脂肪酶對(duì)其的水解率不高，僅為60％左右(飼料工業(yè)雜志2008第 12期P8-11)。其可能的原因是在于脂肪酶對(duì)飽和脂肪酸的底物特異性無(wú)法滿足油脂加工行業(yè)的需求，若能夠進(jìn)一步提高脂肪酶對(duì)飽和脂肪酸的特異性，可以預(yù)期提高對(duì)動(dòng)物油脂的水解效率。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問題，本發(fā)明通過理性設(shè)計(jì)華根霉(Rhizopus chinensis)脂肪酶(RCL)突變位點(diǎn)，獲得了飽和脂肪酸特異性提高的突變酶，并且提高了對(duì)動(dòng)物油的水解率。

本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種脂肪酶突變體，所述脂肪酶突變體相對(duì)于具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的脂肪酶，包括脂肪酶底物結(jié)合口袋的一個(gè)、兩個(gè)或三個(gè)氨基酸殘基的變化；所述變化增加口袋空間位阻；所述變化與脂肪酶對(duì)飽和脂肪酸的特異性相關(guān)。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述脂肪酶突變體是在氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示的序列的基礎(chǔ)上，將第286位的蘇氨酸突變?yōu)楣劝滨０罚蛘邔⒌?81位的異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼幔蛘邔⒌?16位的丙氨酸突變?yōu)樯彼岬耐瑫r(shí)將第281位的異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼帷?/p>

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述脂肪酶突變體的氨基酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3或SEQ ID NO.4所示。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，第286位的蘇氨酸突變?yōu)楣劝滨０返玫酵蛔凅wT286Q；第 281位的異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼岬玫降耐蛔凅w為I281F；將第116位的丙氨酸突變?yōu)樯彼岬耐瑫r(shí)將第281位的異亮氨酸突變?yōu)楸奖彼岬玫降耐蛔凅w為A116W/I281F。

本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供編碼所述脂肪酶突變體的基因序列。

本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供攜帶所述基因序列的質(zhì)粒或細(xì)胞。

在本發(fā)明的一種實(shí)施方式中，所述細(xì)胞為細(xì)菌、真菌或古菌。