[發(fā)明專利]轉(zhuǎn)蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制及應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810094805.5
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN108192915A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 羅顏榮;陳坤明;袁博;李永輝;吳兆鋒;魏偉;劉捷;白帆
• 申請（專利權(quán)）人: 深圳市沃地污染修復(fù)技術(shù)有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/66;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/20;B09C1/10
• 代理公司: 廣州三環(huán)專利商標(biāo)代理有限公司 44202
• 代理人: 張艷美;郝傳鑫

本發(fā)明公開一種轉(zhuǎn)蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制，包括：克隆蜈蚣草中PvACR2基因；以植物表達(dá)載體為基礎(chǔ)，構(gòu)建包含強(qiáng)啟動子、篩選基因的轉(zhuǎn)化載體，將所述PvACR2基因通過同源重組方法插入所述轉(zhuǎn)化載體，獲得超量表達(dá)雙元載體；將所得超量表達(dá)雙元載體通過根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)入油菜下胚軸切段中，培育轉(zhuǎn)基因苗并篩選轉(zhuǎn)基因陽性植株；其中，轉(zhuǎn)基因受體植株為甘藍(lán)型油菜K407品種。本發(fā)明提供的培育方法可解決野生重金屬富集植株耐性有限、成長緩慢、生物量小、生長環(huán)境特殊以及重金屬重返等問題。此外，本發(fā)明還提供一種轉(zhuǎn)蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制中所得的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因植株在土壤重金屬修復(fù)中的應(yīng)用。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于轉(zhuǎn)基因植株和重金屬污染治理領(lǐng)域，具體涉及轉(zhuǎn)蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制及應(yīng)用。

背景技術(shù)

重金屬污染問題已成為一個世界性重大環(huán)境問題，重金屬污染不僅威脅動植物、微生物生產(chǎn)發(fā)育，還通過食物鏈等威脅人類健康乃至生命。導(dǎo)致土壤污染的重金屬主要有As、Cd、Co、Cr、Cu、Hg等，一般為幾種重金屬的復(fù)合污染。重金屬礦區(qū)、經(jīng)濟(jì)高速發(fā)展區(qū)的重金屬污染情況尤為嚴(yán)重，導(dǎo)致我國許多農(nóng)產(chǎn)品由于重金屬超標(biāo)而被拒絕進(jìn)入國際市場。

各國對重金屬污染的生態(tài)效應(yīng)和防治的研究越來越重視，已探索出多種治理技術(shù)。然而傳統(tǒng)的重金屬污染技術(shù)如土壤固化、玻璃化、淋濾化、洗土法、客土法、電化學(xué)法等物理化學(xué)方法，不僅成本高昂，難以大規(guī)模使用，而且常常導(dǎo)致土壤結(jié)構(gòu)破壞、土壤生物活性下降和土壤肥力退化。因此，尋求一種廉價而永久有效，又可以維持土壤肥力的替換方法一直是國際上研究的難點(diǎn)和熱點(diǎn)。

利用綠色植物清除污染物的策略，即植物修復(fù)技術(shù)具有成本低，環(huán)境友好和可再利用等特點(diǎn)，是一種非常有前景的環(huán)境污染原位治理途徑。廣義的植物修復(fù)指通過植物萃取、轉(zhuǎn)化、固定、揮發(fā)、降解作用將土壤及水體中有機(jī)污染物、重金屬等污染物清除的過程。通過種植具有重金屬富集能力的植物，將植物收割并妥善處理(如灰化等)，以到達(dá)將重金屬移出土壤環(huán)境，清除土壤重金屬污染的目的。

基因是決定植物對土壤重金屬吸收積累特性的最重要因素，重金屬富集植物耐重金屬的機(jī)制主要包括三個方面，第一，排斥機(jī)制，阻礙重金屬的吸收或體內(nèi)運(yùn)輸，吸收后又排出體外；第二，局域化機(jī)制，使重金屬在植物的液泡、表皮毛、細(xì)胞壁等特定部位積累，從而與細(xì)胞中的其他組分隔離，達(dá)到解毒的效果；第三，絡(luò)合機(jī)制，植物體內(nèi)物質(zhì)與重金屬絡(luò)合，包括與無機(jī)物絡(luò)合形成硫化物，與小分子有機(jī)物如GSH、草酸、組氨酸和檸檬酸等絡(luò)合后在液泡中聚集，與大分子的金屬鏊合蛋白絡(luò)合。但目前，野生重金屬富集植株存在耐性有限、成長緩慢、生物量小、生長環(huán)境特殊、以及重金屬重返等問題。基因工程技術(shù)是目前土壤重金屬修復(fù)研究中最具前景的高新生物技術(shù)，因此，將植物的重金屬超富集基因克隆并轉(zhuǎn)移到生物量大、生產(chǎn)迅速的植物上以提高植物修復(fù)的能力，是解決土壤重金屬污染問題的有效方法。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的目的在于提供一種轉(zhuǎn)蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制及應(yīng)用，解決野生重金屬富集植株存在耐性有限、成長緩慢、生物量小、生長環(huán)境特殊、以及重金屬重返等問題。

為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供一種轉(zhuǎn)蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的創(chuàng)制，具體指重金屬超富集轉(zhuǎn)基因工程油菜的構(gòu)建方法，包括：

(1)重金屬超富集基因的克隆，克隆蜈蚣草中PvACR2基因，蜈蚣草(Pterisvittata)是在我國南方礦區(qū)發(fā)現(xiàn)的一種重金屬超富集植物。因其對重金屬具有超強(qiáng)的抗性和富集能力，是目前重金屬污染土壤修復(fù)試驗(yàn)的一種主要的修復(fù)植物。PvACR2是負(fù)責(zé)三價砷離子還原的重要蛋白，研究結(jié)果表明，PvACR2是蜈蚣草進(jìn)行砷積累與解毒的關(guān)鍵基因，對植株在含砷土壤環(huán)境中維持正常生長發(fā)育具有重要作用；