[發明專利]轉蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉基因工程油菜的創制及應用

在審

• 申請號: 201810094805.5
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN108192915A
• 公開（公告）日: 2018-06-22
• 發明（設計）人: 羅顏榮;陳坤明;袁博;李永輝;吳兆鋒;魏偉;劉捷;白帆
• 申請（專利權）人: 深圳市沃地污染修復技術有限公司
• 主分類號: C12N15/82
• 分類號: C12N15/82;C12N15/29;C12N15/66;A01H4/00;A01H5/00;A01H6/20;B09C1/10
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 張艷美;郝傳鑫

1.一種轉蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉基因工程油菜的創制，其特征在于，包括：

(1)重金屬超富集基因的克隆

克隆蜈蚣草中PvACR2基因；

(2)超量表達雙元載體的構建

以植物表達載體為基礎，構建包含強啟動子、篩選基因的轉化載體，將步驟(1)克隆得到的PvACR2基因通過同源重組方法插入所述轉化載體，獲得超量表達雙元載體；

(3)重金屬超富集轉基因植株構建

將步驟(2)所得的超量表達雙元載體通過根癌農桿菌轉入油菜下胚軸切段中，用篩選培養基進行篩選培養，獲得的轉基因抗性油菜下胚軸切段經過誘導、分化、生根、轉基因苗的鍛煉和移栽，篩選重金屬超富集轉基因陽性植株；

其中，所述PvACR2基因核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示，所述油菜品種為甘藍型油菜K407。

2.如權利要求1所述的轉蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉基因工程油菜的創制，其特征在于，所述步驟(1)中，克隆蜈蚣草中PvACR2基因的方法為：

以蜈蚣草的cDNA為模板，以如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示的序列為引物對進行PCR擴增，得到PvACR2基因。

3.如權利要求1所述的轉蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉基因工程油菜的創制，其特征在于，所述植物表達載體為pCAMBIA1301載體，所述強啟動子為Ubiquitin啟動子，所述篩選基因為Bar篩選基因，所述轉化載體還包括3×Flag標簽。

4.如權利要求3所述的轉蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉基因工程油菜的創制，其特征在于，所述轉化載體的構建方法包括以下步驟：

(a)在所述pCAMBIA1301載體多克隆位點Kpn I和Sac I之間添加所述3×Flag標簽；

(b)采用PCR擴增反應克隆所述pCAMBIA3301載體上的所述Bar篩選基因；

(c)使用內切酶Xho I酶切步驟(a)中獲得的載體，并將所述Bar篩選基因與酶切后的載體進行同源重組；

(d)采用Hind III和BamH I酶切pUN1301載體上的Ubiquitin啟動子；

(e)使用內切酶Hind III和BamH I酶切步驟(c)中獲得的重組載體，并將所述Ubiquitin啟動子與酶切后的重組載體連接。

5.如權利要求4所述的轉蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉基因工程油菜的創制，其特征在于，所述Ubiquitin啟動子的核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示，所述Bar篩選基因核苷酸序列如SEQ ID NO：5所示，所述3×Flag標簽的核苷酸序列如SEQ ID NO：6所示。

6.如權利要求4所述的轉蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉基因工程油菜的創制，其特征在于，步驟(b)中，所述克隆pCAMBIA3301載體上的所述Bar篩選基因的PCR引物序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示。

7.如權利要求3所述的轉蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉基因工程油菜的創制，其特征在于，所述篩選培養基包含草銨膦。

8.如權利要求1所述的轉蜈蚣草PvACR2基因的重金屬超富集轉基因工程油菜的創制，其特征在于，所述植物表達載體為pCAMBIA1301載體，所述強啟動子為2×CaMV35S啟動子，所述篩選基因為HYG篩選基因。