[發明專利]一種鑒別條斑紫菜中是否夾雜壇紫菜的方法

在審

• 申請號: 201810093750.6
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108342501A
• 公開（公告）日: 2018-07-31
• 發明（設計）人: 任利華;孫國華;徐英江;田秀慧;張秀珍;王鳳青
• 申請（專利權）人: 山東省海洋資源與環境研究院
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6851
• 代理公司: 煙臺智宇知識產權事務所(特殊普通合伙) 37230
• 代理人: 李增發

本發明公開了一種鑒別條斑紫菜中是否夾雜壇紫菜的方法，開發特異引物序列PorF和PorR，將待檢測樣品與條斑紫菜中混入1%壇紫菜的標準品均利用CTAB法提取DNA，利用提取DNA進行熒光定量PCR反應檢測壇紫菜成分的有無和相對百分含量；與現有技術相比，本發明簡單快速，取樣量少，結果穩定可靠，在檢測目的壇紫菜成分有無的基礎上，一定程度反映了樣品中壇紫菜成分含量。

技術領域

本發明屬于涉及一種鑒別條斑紫菜中是否夾雜壇紫菜的方法，屬水產品質量安全技術領域。

背景技術

條斑紫菜和壇紫菜同屬紫菜屬，在外觀上比較相似，經加工后更是無法肉眼區分，普通感官判斷方法無法鑒定。即食海苔是以條斑紫菜為主要原料，添加或不添加食品添加劑及其它原料，經烘烤等工藝制成的可直接食用的食品。海苔產品含有豐富的鈣、鉀、碘、鐵、鋅等礦物質、維生素、蛋白質和膳食纖維，口感香脆，入口即化，味道鮮美，綠色無污染的特性滿足了現代消費者營養和口感需求，深受消費者喜歡。而壇紫菜由于其藻體厚、膠質多，通常是通過簡易的烘干設備制成價格低廉的大散菜、菜餅；目前市場上偶有出現在條斑紫菜中摻雜壇紫菜進行加工成高價海苔的現象，擾亂了市場秩序，破壞了商業誠信，損害了消費者利益。

鑒于此種情況，快速、準確的鑒別條斑紫菜中是否夾雜壇紫菜是十分必要的。線粒體DNA序列常用于物種的鑒定，但條斑紫菜和壇紫菜親緣關系較近，兩者基因組DNA序列差異很少，通用的DNA條形碼-細胞色素C氧化酶亞基I基因(COI)的片段無法把兩者區分。

發明內容

針對市售即食海苔（條斑紫菜）中摻入價值較低的壇紫菜的問題，本發明通過分析條斑紫菜和壇紫菜線粒體序列差異，設計特異擴增壇紫菜引物序列，以條斑紫菜中混合1%的壇紫菜為標準樣品，提取標準樣品和混合樣品DNA，進行熒光PCR擴增，檢測待檢樣品中壇紫菜的有無及相對含量，建立市售即食海苔（條斑紫菜）中壇紫菜的鑒別技術。

這種鑒別條斑紫菜中是否夾雜壇紫菜的方法，采取的技術方案是：

將待檢測樣品與條斑紫菜中混入1%壇紫菜的標準品均利用CTAB法提取DNA，利用提取DNA進行熒光定量PCR反應檢測壇紫菜成分的有無和相對百分含量；包括特異引物的開發和熒光定量PCR體系的建立，所述特異引物為PorF: 5’-TTC CAG GAA GGT TTT AGA ACC T-3’， PorR: 5’-GAC AAA ACA GCC TAG TTT TTG C-3’；引物來自于壇紫菜線粒體序列，可以特異擴增壇紫菜序列，但不能擴增條斑紫菜序列。

進一步地，所述特異引物的序列是將壇紫菜和條斑紫菜線粒體序列從NCBI 下載，經過比對分析，找出序列差異位點，在壇紫菜線粒體序列（JQ736808.1）10104-10224位置之間121bp片段設計引物。

進一步地，熒光定量PCR所用引物為所述特異引物PorF和PorR，內參序列為UBCF-TCA CAA CGA GGA TTT ACC ACC；UBCR-GAG GAG CAC CTT GGA AAC G；實驗所用熒光定量SYBR GreenⅠ PCR體系：SYBR FAST Qpcr Kit Master Mix (2×) Universal5.2μl，PrimerF (10μM) 0.4μl，Primer R (10μM) 0.4μl，DNA 1μl，H2O 補齊至10μl；實驗所用PCR擴增程序：95℃ 3min，95℃ 3s，60℃ 20s，40個循環；溶解曲線程序：95℃ 15s，60℃15s，95℃15s。

進一步地，數據分析采用相對定量常用－ΔΔCT法，以1%標準品為參照；未知檢測樣品中壇紫菜含量百分數＝2－ΔΔCT *1%；ΔΔCT＝（CT靶基因Por－CT內參UBC）檢測樣品－（CT靶基因Por－CT內參UBC）1%標準樣品。

本發明的特點在于：

1、以壇紫菜和條斑紫菜線線粒體差異序列為基礎設計引物，引物擴增結果穩定可靠。