[發(fā)明專利]單亞基RNA聚合酶、其純化方法及在RNA合成中的應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810093606.2
• 申請(qǐng)日: 2018-01-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108018271B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱斌;吳慧;陸雪玲;夏恒;黃鋒濤
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 武漢核圣生物技術(shù)有限公司
• 主分類號(hào): C12N9/12
• 分類號(hào): C12N9/12;C12P19/34
• 代理公司: 南京縱橫知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 徐瑛

本發(fā)明公開(kāi)單亞基RNA聚合酶、其純化方法及在RNA合成中的應(yīng)用。所述的單亞基RNA聚合酶，為來(lái)自φKMV類噬菌體的單亞基RNA聚合酶；或來(lái)自與所述φKMV類噬菌體的單亞基RNA聚合酶的蛋白質(zhì)序列同源性高于25%并含有如序列表SEQ ID NO.1所示的特征氨基酸序列，且總氨基酸序列數(shù)目在800~830之間的其他噬菌體單亞基RNA聚合酶。經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)本發(fā)明提供的RNA聚合酶與現(xiàn)有的RNA工具酶親緣關(guān)系較遠(yuǎn)，其轉(zhuǎn)錄效率較高。在與現(xiàn)有T7 RNA聚合酶和Syn5 RNA聚合酶相比較時(shí)，針對(duì)后二者在合成富含穩(wěn)定高級(jí)結(jié)構(gòu)RNA時(shí)產(chǎn)物復(fù)雜的問(wèn)題，本發(fā)明單亞基RNA聚合酶顯示出轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物均一的顯著優(yōu)點(diǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于微生物核酸代謝酶研究領(lǐng)域，具體涉及單亞基RNA聚合酶、其純化方法及在RNA合成中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

RNA(核糖核酸)是所有生物遺傳信息傳遞的最重要的一類大分子，同時(shí)在生物體內(nèi)也扮演著多種多樣的調(diào)控角色。近年來(lái)RNA研究已成為生物學(xué)研究中最熱門的領(lǐng)域之一。RNA主要包括mRNA、tRNA、rRNA等大類，隨著近些年生物學(xué)技術(shù)的快速發(fā)展，科學(xué)家們發(fā)現(xiàn)一些新穎的RNA如microRNA(miRNA)(Cheng et al.,2005)、long non-coding RNA(lncRNA)(Shi et al.,2016)、nanostructure RNA(Geary et al.,2014)等也對(duì)生物體發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。設(shè)計(jì)好的RNA序列可以編碼，并可被翻譯為任何蛋白質(zhì)，因此理論上可以替代現(xiàn)存的任何蛋白質(zhì)藥物；且RNA結(jié)構(gòu)相較蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)要簡(jiǎn)單得多，容易構(gòu)建。RNA作為藥物的另一個(gè)巨大優(yōu)點(diǎn)是代謝快、半衰期短、翻譯產(chǎn)生蛋白質(zhì)后迅速被降解，相比基因治療(改變DNA產(chǎn)生永久不可逆的效果)副作用幾乎不必考慮。小RNA還可以通過(guò)翻譯以外的機(jī)制如RNA干擾(RNAi)以及RNA指導(dǎo)的基因編輯(CRISPR gRNA)治療疾病。隨著RNA導(dǎo)入細(xì)胞方法的完善，以及各種增強(qiáng)穩(wěn)定性及減少免疫反應(yīng)的RNA修飾方法的發(fā)現(xiàn)，RNA治療在美國(guó)已成為最熱門的藥物研究方向。大型制藥公司如Merck、AstraZeneca、Shire等紛紛投入力量重點(diǎn)開(kāi)發(fā)RNA藥物。

正是由于這些圍繞RNA的研究和應(yīng)用相繼大量開(kāi)展，對(duì)RNA體外合成在質(zhì)和量?jī)煞矫嫣岢隽撕芨叩奶魬?zhàn)。而RNA的體外制備恰恰是RNA研究和應(yīng)用的最大瓶頸。由于RNA本身不穩(wěn)定的性質(zhì)，RNA的化學(xué)合成遠(yuǎn)不如DNA合成高效，化學(xué)合成RNA僅限于小RNA(幾到幾十個(gè)核苷酸長(zhǎng)度)，隨著RNA長(zhǎng)度的增加，化學(xué)合成的成本迅速上升。RNA長(zhǎng)度達(dá)一百個(gè)核苷酸以上化學(xué)合成法已不再適用(Gallo et al.,2005)，而編碼蛋白質(zhì)的RNA通常都長(zhǎng)達(dá)幾千個(gè)核苷酸。目前制備長(zhǎng)RNA唯一的方法是體外酶法合成，酶法合成是指在體外以DNA雙鏈為模板利用RNA聚合酶進(jìn)行轉(zhuǎn)錄合成RNA的一種方法，目前這種利用DNA依賴的RNA聚合酶進(jìn)行體外RNA轉(zhuǎn)錄的技術(shù)廣泛應(yīng)用于雜交分析、晶體結(jié)構(gòu)研究、生物化學(xué)和遺傳研究等(Kessler etal.,2017；Romanienko et al.,2016)。這一方法利用一種簡(jiǎn)單微生物大腸桿菌噬菌體T7的RNA合成機(jī)器——單亞基的T7 RNA聚合酶，在體外從帶有T7啟動(dòng)子序列的DNA模版上反復(fù)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生大量所需的RNA。雖然大部分生物自身?yè)碛蠷NA聚合酶，但是大多都具有復(fù)雜的亞基組成和調(diào)控機(jī)制，不適合用作體外合成RNA的酶工具，只有來(lái)源于某些最小最簡(jiǎn)單的病毒，如T7噬菌體的單亞基RNA聚合酶適合這類用途。自然界中被鑒定的這類單亞基RNA聚合酶只有來(lái)源于噬菌體T7、T3和SP6三種，后兩種在序列和功能上與T7 RNA聚合酶高度相似因而基本被摒棄，因而對(duì)于RNA合成這樣一個(gè)重要的生物技術(shù)人們現(xiàn)在只有一個(gè)酶工具可用。