[發(fā)明專(zhuān)利]單亞基RNA聚合酶、其純化方法及在RNA合成中的應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810093606.2
• 申請(qǐng)日: 2018-01-31
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108018271B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 朱斌;吳慧;陸雪玲;夏恒;黃鋒濤
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 武漢核圣生物技術(shù)有限公司
• 主分類(lèi)號(hào): C12N9/12
• 分類(lèi)號(hào): C12N9/12;C12P19/34
• 代理公司: 南京縱橫知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 32224
• 代理人: 徐瑛

1.單亞基RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA中的應(yīng)用，其特征在于，所述單亞基RNA聚合酶為來(lái)自φKMV類(lèi)噬菌體的單亞基RNA聚合酶；所述單亞基RNA聚合酶的蛋白質(zhì)氨基端含有組氨酸標(biāo)簽，所述組氨酸的編碼堿基序列如序列表SEQ ID NO.2所示；

或者，所述單亞基RNA聚合酶為來(lái)自φKMV類(lèi)噬菌體的單亞基RNA聚合酶，所述單亞基RNA聚合酶的蛋白質(zhì)氨基端含有FLAG標(biāo)簽、HA標(biāo)簽、SBP標(biāo)簽、Avi標(biāo)簽、Nus標(biāo)簽、V5標(biāo)簽中的一種；所述標(biāo)簽與單亞基RNA聚合酶之間由0~10個(gè)氨基酸組成保持柔性的肽段連接。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單亞基RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA中的應(yīng)用，其特征在于，為φKMV類(lèi)噬菌體KP34的RNA聚合酶，所述標(biāo)簽與KP34的RNA聚合酶之間的肽段由10個(gè)氨基酸組成；在KP34的RNA聚合酶與肽段形成的融合蛋白的氨基端處帶有如序列表SEQ ID NO.2所示的組氨酸標(biāo)簽。

3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單亞基RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA中的應(yīng)用，其特征在于，單亞基RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA的方法包括如下步驟：S1.獲得編碼所需RNA的DNA轉(zhuǎn)錄模板；S2.加入所述單亞基RNA聚合酶，轉(zhuǎn)錄模板，pH7.9 Tris-HCl，氯化鎂，亞精胺，DTT，四種核糖核苷三磷酸ATP、GTP、CTP、UTP，RNA酶抑制劑，無(wú)機(jī)焦磷酸酶，DEPC水混合后進(jìn)行體外轉(zhuǎn)錄反應(yīng)。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的單亞基RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA中的應(yīng)用，其特征在于，步驟S2所述轉(zhuǎn)錄反應(yīng)的時(shí)間為1~2h。

5.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的單亞基RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA中的應(yīng)用，其特征在于，所述單亞基RNA聚合酶的純化方法包括如下步驟：（1）鎳柱親和層析：將所述噬菌體的菌體裂解上清液通過(guò)鎳柱，帶所述標(biāo)簽的蛋白與鎳柱結(jié)合，加入由低濃度到高濃度的咪唑溶液與鎳柱競(jìng)爭(zhēng)結(jié)合洗脫蛋白，帶有所述標(biāo)簽的目的蛋白在加入高濃度的咪唑溶液時(shí)被洗脫，收集目的蛋白；（2）Blue親和層析：使用5 mL HiTrap Blue HP進(jìn)行親和層析，用結(jié)合緩沖液平衡5-10個(gè)柱體積，控制液體流速為2-5 mL/min；將步驟（1）處理后的蛋白樣品以同樣的流速過(guò)柱，用結(jié)合緩沖液洗5-10個(gè)柱體積，最后使用5-10個(gè)柱體積洗脫緩沖液通過(guò)不斷提高鹽離子強(qiáng)度進(jìn)行洗脫并收集蛋白；（3）5’-ATP–agarose純化：將5’-ATP–agarose樹(shù)脂用水清洗后用中性緩沖液平衡樹(shù)脂；將步驟（2）處理的蛋白樣品過(guò)柱，再按由低到高濃度的順序用含有10-100 mM ATP或ADP的平衡緩沖液進(jìn)行連續(xù)梯度洗脫，并不斷提高鹽濃度減少非特異結(jié)合的蛋白，收集洗脫蛋白；（4）蛋白透析：將步驟（3）獲得的蛋白進(jìn)行多次透析，收集透析后蛋白置于-20℃保存。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單亞基RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA中的應(yīng)用，其特征在于，步驟（1）所述咪唑溶液的濃度由低到高分別為20 uM、50 uM、100 uM三種濃度，由pH8.0、50 mM磷酸二氫鈉和300 mM NaCl對(duì)咪唑進(jìn)行稀釋得到。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單亞基RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA中的應(yīng)用，其特征在于，步驟（2）所述結(jié)合緩沖液含有pH 7.0、50 mM磷酸二氫鉀或pH 7.0、20 mM磷酸鈉；所述洗脫緩沖液含有pH 7.0、50 mM磷酸二氫鉀和0-1.5 M KCl，或含有pH 7.0、20 mM磷酸鈉、0-2 M NaCl；步驟（3）所述中性緩沖液含有pH 7.5、10 mM HEPES，25 mM NaCl，0.5mM DTT，1 mM EDTA和10%甘油。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的單亞基RNA聚合酶在體外轉(zhuǎn)錄合成富含二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA中的應(yīng)用，其特征在于，所述步驟（4）具體步驟包括：將步驟（3）獲得的蛋白加入透析袋中密封后置于1 L透析液中進(jìn)行透析，2.5~3 h后更換干凈透析液繼續(xù)透析2.5~3 h，最后再次更換透析液透析過(guò)夜，收集透析后蛋白保存；所述透析液含有pH 7.5、20 mM磷酸二氫鉀，0.1 mMDTT，0.1 mM EDTA，50%甘油。