[發明專利]大腸桿菌中具有產氫功能基因的載體pET32a-fdhF-1及其構建和應用

在審

• 申請號: 201810093583.5
• 申請日: 2018-01-31
• 公開（公告）號: CN108220319A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 王海燕;劉偉;趙雅琪;徐嵐婷;王冕超
• 申請（專利權）人: 北京工業大學
• 主分類號: C12N15/70
• 分類號: C12N15/70;C12N15/66;C12N15/53;C12P3/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京思海天達知識產權代理有限公司 11203
• 代理人: 劉萍

大腸桿菌中具有產氫功能基因的載體pET32a?fdhF?1及其構建和應用，涉及基因工程技術領域。pET32a?fdhF?1基因載體為包含有大腸桿菌BL21甲酸脫氫酶fdhF基因的pET32a質粒。其構建是通過設計引物擴增大腸桿菌BL21的甲酸脫氫酶(formate dehydrogenase H)的fdhF基因片段，并通過T4 DNA連接酶將其連接到酶切后的pET32a載體中，命名為pET32a?fdhF?1，進行基因測序，驗證基因的完整性。將pET32a?fdhF?1質粒轉化到大腸桿菌中，在產氫培養基中進行培養產氫。轉入載體pET32a?fdhF?1能提高大腸桿菌產氫效率。

技術領域

本發明涉及基因工程技術領域，特別涉及一種產氫功能基因載體 pET32a-fdhF-1及其構建和應用。

背景技術

目前化石能源逐漸減少，而在新的能源領域中，氫能作為一種無污染的清潔能源及能源載體，近年來其開發與利用技術得到工業化國家的高度重視。當下氫氣生產主要有化石能源轉化，水的分解，以及生物制氫三種方式。前兩種應用廣泛，但污染環境且不具有可持續發展性。生物制氫具有安全、低成本、環境友好以及對可再生物質資源合理利用的優點，若能夠廣泛應用，對環境保護會有重要的意義。由于大腸桿菌相對其他可產氫微生物培養成本低且可實現性強，因此是發展微生物產氫的最佳選擇。野生大腸桿菌不產氫或產氫較少，已有的通過基因工程改造的大腸桿菌不穩定且產氫效率低下，亟待通過人工引入外來基因使其產氫效率有所提高，以滿足人類發展氫能源的需求。

發明內容

本發明的目的是提供一個產氫功能基因載體pET32-fdhF-1及其構建方法。其能夠應用于大腸桿菌BL21中，能使大腸桿菌的產氫效率得到提高。

為解決上述技術問題，本發明所采取的技術方案是：

本發明提供一種產氫功能基因載體pET32a-fdhF-1，其為包含有大腸桿菌的甲酸脫氫酶基因fdhF的pET32a-fdhF-1質粒。(說明：將大腸桿菌中甲酸脫氫酶基因fdhF 進行克隆用于提高產氫量為本發明首創，選用pET32a為載體表達甲酸脫氫酶基因fdhF 也為本發明的創新)

本發明還提供了產氫功能基因載體pET32a-fdhF-1的構建方法，主要通過使用限制性內切酶NdeⅠ和XhoⅠ酶切PCR產物及質粒，再使用T4DNA連接酶連接二者。

(說明：為提高酶切效率，可以先將PCR產物亞克隆到pCloneEZ-TOPO載體，然后再從轉化的細菌中提取質粒并酶切。)

具體操作過程包括以下步驟：(1)DNA片段制備：結合表達載體pET32a上的酶切位點Nde I及XhoI，設計大腸桿菌中甲酸脫氫酶基因fdhF的引物，并使用高保真 DNA聚合酶PCR反應擴增fdhF基因。將PCR產物亞克隆到pCloneEZ-TOPO載體，然后再從轉化的細菌中提取質粒并用Nde I及XhoI酶切，切膠回收fdhF基因片段。

(2)線性化載體制備：使用pET32a為載體，使用Nde I及XhoI雙酶切獲得線性化載體。

(3)連接反應：通過T4DNA連接酶，將準備好的線性化載體和fdhF基因片段連接起來，得到重組載體。

(4)轉化：將構建好的重組載體轉入感受態大腸桿菌DH5α中。

(5)陽性轉化子的鑒定：挑取克隆菌，使用擴增fdhF基因所用的引物，進行菌落PCR反應，通過電泳進行鑒定，確定陽性轉化子后，再提取質粒、測序。

本發明還提供產氫功能基因載體pET32a-fdhF-1的應用：將pET32a-fdhF-1 質粒轉化到大腸桿菌BL21中，在產氫培養基中培養進行產氫。(說明：選用大腸桿菌 BL21為宿主菌，將構建的質粒轉化到此菌中用于產氫反應，也是本發明的創新。)