[發明專利]復制型重組腺病毒HAdV-5載體系統及其應用

有效

• 申請號: 201810092715.2
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN108048483B
• 公開（公告）日: 2021-02-02
• 發明（設計）人: 魯茁壯;劉紅軍;鄒小輝
• 申請（專利權）人: 中國疾病預防控制中心病毒病預防控制所;北京知光基因科技有限公司
• 主分類號: C12N15/861
• 分類號: C12N15/861
• 代理公司: 中科專利商標代理有限責任公司 11021
• 代理人: 崔亞松

本發明提供一種復制型重組腺病毒HAdV?5載體系統，其包括骨架質粒pKAd5、中間質粒pMDXE3YA和穿梭質粒pKNXE3M。將目的基因編碼區克隆到穿梭質粒的多克隆位點，EcoRI酶切攜帶目的基因的穿梭質粒，用所得片段替換中間質粒的對應部位；再用NdeI酶切新構建的中間質粒，用所得片段替換骨架質粒的對應部位，可獲得重組腺病毒質粒；PacI線性化的重組腺病毒質粒轉染293細胞，能夠制備由HAdV?5主要晚期啟動子(MLP)控制目的基因表達的重組HAdV?5腺病毒。該重組腺病毒在各種人類細胞中均可以復制增殖，是復制型病毒，預計其在動物口服載體疫苗研發中具有廣闊的應用前景。

技術領域

本發明屬于重組疫苗領域，具體而言，本發明涉及一種復制型重組腺病毒HAdV-5載體系統及其應用。

背景技術

口服疫苗具有眾多優點^[1，2]。肌注疫苗使用注射器，需要醫護人員參與，常需要多次免疫，疫苗用量大，純化工藝相對復雜，成本高。口服疫苗能夠彌補肌注疫苗的不足，活疫苗接種劑量小，無需進行嚴格的純化，成本低；接種方便，無需專業醫護人員，依從性好。粘膜為病原體進入屏障，而口服疫苗能夠引發較強的粘膜免疫，直接將病原體攔截在機體之外；減毒口服疫苗能引發較強的細胞免疫，有利于進入體細胞病原體的清除。

人5型腺病毒(HAdV-5)是理想的疫苗載體^[3]。腺病毒載體基因轉移效率高，生產純化方便，安全性好，是基因治療臨床試驗中使用最多的載體；在重組疫苗研究中得到廣泛應用。2006年，加拿大批準了一種以HAdV-5為載體的狂犬病疫苗，商品名為onRAB，這種疫苗是將狂犬病病毒的糖蛋白基因插入到HAdV-5 E3區獲得的一種載體疫苗。該疫苗在多種野生動物進行了測試，包括馬、豬、羊、狗、貓、雞、田鼠、狐貍、棉鼠、松鼠、兔、美洲旱獺、牛等，證明對所有測試動物都非常安全，而且刺激產生了抗體。將其制備成餌料，通過簡單的口服給藥，即能產生保護性免疫^[4-6]。自2006年，加拿大通過飛機投放的方式，在森林里投放了幾百萬份這種疫苗誘餌，美國也開展了多次場地實驗，均獲得非常好的免疫效果。

目前有多種商業化的基于HAdV-5的復制缺陷載體系統，然而，這種載體感染靶細胞后病毒不能復制，僅起到基因轉移載體的功能。目前還未見商業化的復制型HAdV-5載體系統的相關報道。如前所述，復制型HAdV-5中目的基因表達效率更高，可作為更有效的哺乳動物口服疫苗載體。因此，本領域對復制型腺病毒載體系統(例如，復制型HAdV-5載體系統)存在需求。

發明內容

為了滿足本領域的需求，本發明的目的是提供一種復制型重組腺病毒HAdV-5載體系統。

本發明人由野生型人5型腺病毒(HAdV-5)出發，構建了可在E3區插入目的基因的復制型HAdV-5載體系統。

在第一方面，本發明提供一種復制型重組腺病毒HAdV-5載體系統，所述載體系統包括骨架質粒、中間質粒和穿梭質粒。本發明人將所述骨架質粒命名為pKAd5，所述中間質粒命名為pMDXE3YA，并且所述穿梭質粒命名為pKNXE3M。換言之，本發明所述的復制型重組腺病毒HAdV-5載體系統包括骨架質粒pKAd5、中間質粒pMDXE3YA和穿梭質粒pKNXE3M。在一個優選的實施方案中，所述復制型重組腺病毒HAdV-5載體系統由骨架質粒pKAd5、中間質粒pMDXE3YA和穿梭質粒pKNXE3M組成。

其中，骨架質粒pKAd5由本發明人設計并構建得到(見實施例1和圖1)，其含有pBR322質粒的復制起點(ORI)、卡那霉素的抗性基因(KAN)和HAdV-5基因組(Genbankaccession number：AY339865)。本發明人通過將經PCR獲得的ORI-KAN片段(SEQ ID NO：2)與野生型HAdV-5基因組序列(Genbank accession number：AY339865)進行DNA組裝(DNAassembly)得到骨架質粒pKAd5。