[發明專利]鉤吻素己半抗原和全抗原及其制備方法與應用

有效

• 申請號: 201810089277.4
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN108409749B
• 公開（公告）日: 2019-09-06
• 發明（設計）人: 楊術鵬;李熠;張金振;周金慧;張靜;關利娟;金玥;袁媛;王鵬;趙文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蜜蜂研究所
• 主分類號: C07D491/22
• 分類號: C07D491/22;C07K14/765;C07K14/77;C07K14/795;C07K1/107;G01N33/531;G01N33/558;G01N33/577
• 代理公司: 北京路浩知識產權代理有限公司 11002
• 代理人: 王文君;黃爽

本發明涉及鉤吻素己半抗原和全抗原及其制備方法與應用。本發明首先將鉤吻素己中不飽和胺基加氫還原，暴露其活性的氨基，然后與酸酐反應，得到含有羧基基團的化合物，即為鉤吻素己半抗原；再將半抗原與載體蛋白偶聯獲得其全抗原。利用本發明的全抗原免疫動物可以產生針對鉤吻素己的特異性抗體，可用于建立鉤吻素己的酶聯免疫吸附分析方法和膠體金試紙條快速檢測法，從而用于快速檢測鉤吻素己導致的食物中毒，應用前景廣闊。

技術領域

本發明屬于生物化工技術領域，具體地說，涉及鉤吻素己半抗原和全抗原及其制備方法與應用。

背景技術

鉤吻是馬錢科的一種開花植物，廣泛分布于嶺南地區(廣東、廣西和福建南部)，因其全株有毒且毒性強烈，也稱之為斷腸草，大茶藥等。鉤吻的花朵呈黃色且鮮艷，人們易于將其誤認為金銀花而食用，從而導致鉤吻中毒事件頻發。此外，鉤吻還是我國重要的有毒蜜源植物，當其它蜜源匱乏，鉤吻成為當地優勢蜜源植物時，蜜蜂便會采集其花蜜釀制有毒蜂蜜，人一旦誤食此蜂蜜便會發生中毒反應，嚴重者甚至致人死亡。鉤吻中毒患者主要表現為視力障礙和呼吸中樞神經系統的麻痹，中毒的潛伏期短，嚴重者多因呼吸麻痹而死亡?？梢?，在嶺南地區由鉤吻引發的中毒問題突出，急需開發出高靈敏度、高特異性、簡單、快速的分析方法，輔助食物中毒的診斷和鑒別。

鉤吻的高毒性主要是由吲哚類生物堿導致的，目前已經分離鑒定了120余種鉤吻生物堿，其中鉤吻素子和鉤吻素甲含量較高，而鉤吻素己(化學結構見圖2)的毒性最強，其在小鼠中的LD₅₀約為0.2mg/kgB.W.，屬于劇毒性物質。鑒于鉤吻素己的高毒性及其在植物體根莖葉花中廣泛分布，通常將其歸咎為鉤吻中毒的關鍵性物質。此外，研究者從鉤吻有毒蜂蜜中發現了高含量的鉤吻素己，并將其作為鉤吻有毒蜂蜜的生物標志物之一。因此，可以通過檢測食物、蜂蜜中的鉤吻素己來識別和鑒定是否為毒性食物。對于小分子化合物，常見的檢測方法主要可分為基于化合物理化性質的液相色譜、液質聯用、氣質聯用等儀器分析法；以及基于抗原抗體特異性識別的免疫分析法，如酶聯免疫吸附法和膠體金側流層析法等。盡管儀器分析法屬于確證性方法，但是其樣本制備繁瑣、儀器操作復雜、對檢測人員素質要求較高、分析成本昂貴且耗費時間長等弊端，無法滿足快速檢測以及現場檢測需要。ELISA和膠體金試紙條等免疫分析具有高靈敏高特異性、操作簡單快速，非常適合大量的檢測和現場快速檢測。

在免疫分析方法中，抗體是其核心試劑，一旦獲得優良的抗體，便可以設計出多種多樣的免疫分析方法。而獲得高靈敏度、高特異性的抗體的關鍵便是半抗原的設計與合成。鉤吻素己的化學結構中并不存在可供直接的活性基團，這便需要以鉤吻素己的化學結構為基礎，做一定修飾，暴露出可供鏈接的氨基、羧基、羥基等活性基團。目前，未見鉤吻素己半抗原設計與合成的相關報道。為獲得優良的鉤吻素己抗體，建立相關的免疫分析方法。

發明內容

本發明針對目前鉤吻素己抗原合成技術及免疫分析技術的空白，提供一種新型的鉤吻素己半抗原及全抗原合成方法，為高特異性、高靈敏度鉤吻素己單克隆抗體制備及免疫分析方法的建立奠定基礎。

本發明首先將鉤吻素己中不飽和胺基加氫還原，暴露其活性的氨基，然后與酸酐反應得到含有羧基基團的化合物，即為鉤吻素己半抗原；再與載體蛋白偶聯獲得其全抗原。

本發明提供的鉤吻素己半抗原，將鉤吻素己中不飽和胺基加氫還原，暴露其活性的氨基，然后與酸酐反應，得到含有羧基基團的化合物，即為鉤吻素己半抗原。

優選地，本發明鉤吻素己半抗原的結構如式(I)所示：

本發明提供的鉤吻素己全抗原，其是由所述鉤吻素己半抗原與載體蛋白偶聯后得到的。

本發明所述載體蛋白選自BSA、VOA、KLH等。

本發明還提供由所述鉤吻素己全抗原制備的特異性抗體，所述抗體為多克隆抗體或單克隆抗體。