[發明專利]Cebpa基因缺失斑馬魚突變體的制備及其應用

在審

• 申請號: 201810087330.7
• 申請日: 2018-01-30
• 公開（公告）號: CN108103108A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 袁浩;周雋;朱軍
• 申請（專利權）人: 上海交通大學醫學院附屬瑞金醫院
• 主分類號: C12N15/89
• 分類號: C12N15/89;C12N15/90;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識產權代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

本發明公開了一種Cebpa基因缺失斑馬魚突變體的制備及其應用；設計針對斑馬魚cebpa基因的TALEN序列；構建其左右臂質粒，并體外轉錄出相應的mRNA；將TALEN左右臂mRNA混合并顯微注射到斑馬魚受精卵中；注射后的胚胎養至F0成魚與野生型成魚交配，將攜帶有cebpa基因突變的胚胎養至F1成魚；含有cebpa基因突變的F1成魚再與野生型成魚交配，產生的胚胎養至F2成魚，通過剪魚尾鰭抽提基因組DNA的方法鑒定，確定所述突變體。本發明通過TALEN基因編輯技術，能夠快速高效的建立cebpa基因缺失斑馬魚品系，利用該模型能夠開展針對治療白血病，肝臟發育不良以及粒細胞缺失等疾病的藥物篩選工作。

技術領域

本發明屬于基因編輯技術領域，涉及一種由TALEN介導的Cebpa基因缺失型斑馬魚突變體的制備及其應用。

背景技術

CCAAT增強子結合蛋白α(CCAAT/enhancer-binding proteinα，C/EBPα)是C/EBPs轉錄因子家族中的重要成員，由單一外顯子編碼，其C端具有高度保守的DNA結合結構域和二聚化功能域(basic region and leucine zipper domain，bZIP)。研究發現，C/EBPα在造血發育，肝臟發育以及脂肪細胞分化等過程中發揮著重要作用，其功能異常更是與多種疾病的發生及發展密切相關。在急性髓系白血病患者中，C/EBPα基因突變率大約為5％-14％。

斑馬魚作為一種新興的模式生物，兼具了“小模式生物”(如酵母，線蟲，果蠅)和“大模式生物”(如小鼠)的眾多優勢：斑馬魚成魚體長3-4cm，易于實驗室大規模飼養；一次交配可產數百枚胚胎，方便進行大規模的化學誘變劑突變篩選及活體高通量藥物篩選；從受精卵發育到性成熟個體時間短，僅需2-3個月時間；斑馬魚體外受精，胚胎體外發育，早期透明，易于實時觀測和操作；二倍體生物，斑馬魚基因組測序工作已經完成，其許多信號通路及重要基因都與人類高度保守，并且其神經系統，免疫系統，心血管系統，生殖系統等的發育和功能也與人類有許多的共同點，可以作為研究人類發育和疾病的動物模型。此外，隨著研究的深入，許多研究手段和方法也都日趨成熟。由此可見，斑馬魚是一種非常理想的研究脊椎動物遺傳和發育的模式生物。

TALE(Transcription Activator-Like Effector)是由植物病原體黃單胞菌(Xanthomonas)分泌的一類具有轉錄激活功能的蛋白，該蛋白由一些非常保守的重復氨基酸序列模塊組成，每個模塊一般包含33-35個氨基酸，其中第12，13位氨基酸種類可變且決定了TALE與DNA結合的特異性。通過將TALE與限制性內切酶FokI融合便形成了一類具有特異性基因組編輯功能的強大工具-TALEN(transcription activator-like effectornucleases)。在細胞內TALEN與基因組的靶位點結合，并當FokI形成二聚體后便發揮內切酶活性對DNA雙鏈進行切割，從而造成DNA雙鏈損傷。當DNA損傷后，機體會啟動兩種修復機制，一種為非同源性末端接合機制(Non-homologous End Joining，NHEJ)，另一種為同源重組修復機制(homologous recombination)。在沒有外源的同源序列加入時，細胞便會啟動NHEJ修復機制，將斷裂的DNA末端重新連接在一起。但是，這種修復機制是一種快速的，非精確的修復，極易發生錯誤(缺失/插入)，從而造成移碼突變，因而最終可以達到基因敲除的目的。作為一種新興的基因組編輯技術，TALEN系統具有操作簡單，時間短，成本低等優勢。

CRISPR/Cas技術作為另一種基因組編輯工具，能夠完成RNA導向的DNA識別及編輯。雖然CRISPR/Cas技術在靶位點設計上更靈活，簡便，但是其特異不高，脫靶率遠高于TALEN技術，并且其基因打靶效率也低于TALEN技術。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術存在的不足，提供一種由TALEN介導的Cebpa基因缺失型斑馬魚突變體的制備及其應用。cebpa基因與多種疾病的發生及發展密切相關，此模型的建立將具有很好的醫學研究價值和商業應用價值。