[發(fā)明專利]Cebpa基因缺失斑馬魚突變體的制備及其應(yīng)用

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810087330.7
• 申請(qǐng)日: 2018-01-30
• 公開（公告）號(hào): CN108103108A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 袁浩;周雋;朱軍
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院
• 主分類號(hào): C12N15/89
• 分類號(hào): C12N15/89;C12N15/90;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 上海伯瑞杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 31227
• 代理人: 曹莉

1.一種Cebpa基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，所述方法包括如下步驟：

S1、設(shè)計(jì)針對(duì)斑馬魚cebpa基因的TALEN序列；

S2、構(gòu)建TALEN的左、右臂質(zhì)粒，并分別體外轉(zhuǎn)錄出TALEN左、右臂mRNA；

S3、將TALEN左、右臂mRNA混合并顯微注射到斑馬魚受精卵中；

S4、將注射后的胚胎養(yǎng)至F0成魚，并與野生型成魚交配，對(duì)產(chǎn)生的胚胎進(jìn)行限制性內(nèi)切酶方法以及DNA測(cè)序方法鑒定，將攜帶有cebpa基因突變的胚胎養(yǎng)至F1成魚；

S5、對(duì)F1成魚進(jìn)行剪魚尾鰭抽提基因組DNA方法鑒定是否存在cebpa基因突變，并通過DNA測(cè)序方法確定其cebpa基因突變類型，將含有cebpa基因突變的F1成魚再次與野生型成魚交配，產(chǎn)生的胚胎養(yǎng)至F2成魚；

S6、對(duì)F2成魚通過剪魚尾鰭抽提基因組DNA的方法鑒定，確定突變魚系，該突變魚系即所述Cebpa基因缺失斑馬魚突變體。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cebpa基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，步驟S1中，TALEN序列的左臂序列如SEQ ID N0.1所示，TALEN序列的右臂序列如SEQ ID N0.2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cebpa基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，步驟S2中還包括注射后待胚胎發(fā)育至2-3天，挑選若干枚正常發(fā)育的胚胎，抽提基因組DNA，并對(duì)cebpa基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增，PCR擴(kuò)增產(chǎn)物通過限制性內(nèi)切酶的方法鑒定TALEN是否有效的步驟。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的Cebpa基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，對(duì)cebpa基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增采用的引物序列如SEQ ID N0.3、SEQ ID N0.4所示。

5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cebpa基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，步驟S6中還包括克隆斑馬魚cebpa突變基因至pCS2+表達(dá)載體中，通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)檢測(cè)該突變C/ebp α是否還具有轉(zhuǎn)錄活性功能的步驟。

6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cebpa基因缺失斑馬魚突變體的制備方法，其特征在于，步驟S6中還包括將F2代cebpa突變體自交產(chǎn)生的胚胎養(yǎng)至4-6天，利用蘇丹黑染色的方法檢測(cè)cebpa基因敲除胚胎的粒細(xì)胞發(fā)育情況的步驟。

7.一種根據(jù)權(quán)利要求1所述的Cebpa基因缺失斑馬魚突變體的制備方法建立的cebpa基因缺失斑馬魚模型在作為針對(duì)治療白血病，肝臟發(fā)育不良以及粒細(xì)胞缺失疾病的藥物篩選模型中的用途。