[發(fā)明專利]一種模擬恩諾沙星的抗原表位肽、其制備方法及應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810086387.5
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108387740B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄧省亮;李平;賀偉華;賴衛(wèi)華
• 申請（專利權(quán)）人: 江西省科學(xué)院微生物研究所
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;G01N33/68
• 代理公司: 南昌大牛專利代理事務(wù)所(普通合伙) 36135
• 代理人: 喻莎

本發(fā)明提供了一種模擬恩諾沙星的抗原表位肽、其制備方法及應(yīng)用。該技術(shù)方案首先基于噬菌體展示肽庫技術(shù)，以抗ENR單克隆抗體為靶標，從噬菌體隨機展示七肽庫中淘選得一種序列為GKPYITW的ENR抗原模擬表位。本發(fā)明分別給出了通過噬菌體擴增手段、通過基因重組手段制備該抗原模擬表位的方法。本發(fā)明圍繞該抗原模擬表位的免疫結(jié)合特性，基于酶聯(lián)免疫吸附法、膠體金免疫層析法、熒光微球免疫層析法設(shè)計了具體的檢測方法。該抗原模擬表位具有與天然ENR分子相似的免疫反應(yīng)特性，可以替代耐藥性強且價格昂貴的ENR標準品用于ENR的免疫學(xué)檢測，檢測結(jié)果準確、靈敏度高。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及噬菌體展示肽庫技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種模擬恩諾沙星的抗原表位肽、其制備方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)

恩諾沙星(Enrofloxacin，ENR)，屬于氟喹諾酮類的代表性藥物，由于使用方便、成本低廉、療效顯著，廣泛用于動物養(yǎng)殖領(lǐng)域細菌、病毒感染性動物疾病的治療和控制。在養(yǎng)殖業(yè)中，一些養(yǎng)殖者不遵循動物休藥期，通過濫用ENR 來獲取更大的經(jīng)濟利益，以致使ENR在動物源性食品中成為一個普遍現(xiàn)象。大量研究表明，長期食用含有ENR殘留的食品能夠造成人的耐藥性，引起消化系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)和泌尿生殖系統(tǒng)等系統(tǒng)的不良反應(yīng)以及過敏反應(yīng)。近年來我國畜禽產(chǎn)品由于該類藥物殘留超標屢遭出口限制時有發(fā)生。因此，加強ENR抗生素殘留高靈敏快速檢測研究顯得尤為重要。

目前，食品中ENR的檢測方法主要有高效液相色譜、氣相色譜、高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜、氣相色譜串聯(lián)質(zhì)譜和免疫分析等方法，免疫分析方法以其簡單方便、靈敏度高、成本較低等特性在ENR的檢測中得到了廣泛的應(yīng)用。但是，在實施免疫分析檢測的過程中，必須使用ENR標準品為基礎(chǔ)原材料來制備競爭抗原或者固相包被抗原，ENR不僅導(dǎo)致人和動物易產(chǎn)生耐藥性現(xiàn)象，而且價格昂貴，對檢測人員的身體健康和生態(tài)環(huán)境造成極大的危害。近年來研究人員采用抗原模擬表位成功替代小分子抗原進行了免疫學(xué)檢測，在這種情況下，如果能獲取一種與天然ENR具有相似免疫反應(yīng)特性的替代性無毒物質(zhì)，則有望在針對ENR 的免疫檢測方法中避免使用大量的ENR標準品，以期降低檢測成本同時提升安全性。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在針對現(xiàn)有技術(shù)的技術(shù)缺陷，提供一種模擬恩諾沙星的抗原表位肽，以解決現(xiàn)有技術(shù)中缺乏一種與恩諾沙星具有相似免疫反應(yīng)特性、能替代其作敏感型免疫檢檢測元件的技術(shù)問題。

本發(fā)明同時提供了上述模擬恩諾沙星的抗原表位肽的制備方法，以解決其制備方法不明確的技術(shù)問題。

本發(fā)明同時提供了上述模擬恩諾沙星的抗原表位肽在具體免疫檢測方法中的應(yīng)用，以解決現(xiàn)有技術(shù)中的常規(guī)檢測方法未針對該抗原表位肽的免疫學(xué)性質(zhì)進行適應(yīng)性匹配，因而難以獲得最佳檢測效果的技術(shù)問題。

為實現(xiàn)以上技術(shù)目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

一種模擬恩諾沙星的抗原表位肽，其氨基酸序列為：GKPYITW。

一種編碼上述抗原表位肽的基因，其核苷酸序列為： GGTAAGCCTTATTTAACTTGG。

本發(fā)明同時提供了上述抗原表位肽的一種制備方法，包括以下步驟：將具有 ENR抗原模擬表位的噬菌體加入至20ml接種有ER 2738大腸桿菌的培養(yǎng)液中， 37℃150rpm振蕩培養(yǎng)4.5h；將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入另一離心管中，4℃12000g離心 10min，將上清的上部80％轉(zhuǎn)入一新鮮管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4℃靜置過夜；4℃12000g離心15min，沉淀重懸于1mlTBS中，4℃14000rpm離心5min；上清轉(zhuǎn)入另一離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，冰上孵育1h，4℃ 14000rpm離心10min；棄上清，沉淀重懸于200μl TBS中。在該制備方法中，所述具有ENR抗原模擬表位的噬菌體，可以是通過以下淘選方法獲得的：