[發明專利]一種模擬恩諾沙星的抗原表位肽、其制備方法及應用

有效

• 申請號: 201810086387.5
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108387740B
• 公開（公告）日: 2020-04-24
• 發明（設計）人: 鄧省亮;李平;賀偉華;賴衛華
• 申請（專利權）人: 江西省科學院微生物研究所
• 主分類號: C07K7/06
• 分類號: C07K7/06;G01N33/68
• 代理公司: 南昌大牛專利代理事務所(普通合伙) 36135
• 代理人: 喻莎

1.一種模擬恩諾沙星的抗原表位肽，其氨基酸序列為：GKPYITW。

2.一種編碼權利要求1所述抗原表位肽的基因，其核苷酸序列為：GGTAAGCCTTATTTAACTTGG。

3.權利要求1所述抗原表位肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：將具有恩諾沙星抗原模擬表位的噬菌體加入至20ml接種有ER 2738大腸桿菌的培養液中，37℃150rpm振蕩培養4.5h；將培養物轉入另一離心管中，4℃12000g離心10min，將上清上部80％體積的部分轉入另一離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，4℃靜置過夜；4℃12000g離心15min，沉淀重懸于1ml TBS中，4℃14000rpm離心5min；上清轉入另一離心管中，加入1/6體積的PEG/NaCl，冰上孵育1h，4℃14000rpm離心10min；棄上清，沉淀重懸于200μl TBS中。

4.權利要求1所述抗原表位肽的制備方法，其特征在于包括以下步驟：

1)PCR擴增序列為GGTAAGCCTTATTTAACTTGG的DNA片段，分別采用ACC65I和Eag I酶對該DNA片段和pMAl-pIII表達載體進行雙酶切；將質粒pMal-PIII和該DNA片段以1:10的摩爾比混勻，于16℃水浴連接12h，取10μl連接產物加至100μl感受態細胞TB1中，充分混勻；冰浴30min后，42℃水浴熱激90s，立即冰浴5min后補加600μl LB液體培養液，37℃200rpm培養1h，10000rpm離心1min，吸去上清留取約200μl，涂布于LB-A固體培養基中，37℃過夜培養，得到陽性克隆；

2)將上述獲得的陽性克隆子，從平板上挑一單菌落接種于5ml LB-A、0.2％蔗糖中，37℃220rpm振蕩培養過夜，將過夜培養物按1％(v/v)的接種量接種于50ml的LB-A、0.2％蔗糖培養基中，37℃220rpm振蕩培養，當培養物細菌濃度達到OD600nm值為0.6時，向培養物中加入IPTG至終濃度為0.2mM，220rpm振蕩培養，將PEG溶液于4℃4000g離心20min收集菌體沉淀，棄上清；重懸細胞于400ml含有30mM Tris-HCl、20％蔗糖且pH為8.0的溶液中，加入EDTA至

1mM，室溫下震蕩10min，8000g 4℃離心20min，棄上清，沉淀重懸于400ml預冷的5mMMgSO4，冰上震蕩10min，4℃8000g離心20min，保留上清，向上清液中加入8ml pH為7.4、濃度為1M的Tris-HCl，獲得恩諾沙星抗原模擬表位-MBP融合蛋白。

5.權利要求1所述抗原表位肽作為酶聯免疫吸附法的競爭抗原用于檢測食品中恩諾沙星的應用。

6.權利要求1所述抗原表位肽作為酶聯免疫吸附法的固相抗原用于檢測食品中恩諾沙星的應用。

7.權利要求1所述抗原表位肽作為膠體金試紙的檢測線用于檢測食品中恩諾沙星的應用。

8.根據權利要求7所述的應用，其特征在于包括以下步驟：

用10mM PBS緩沖液稀釋具有恩諾沙星抗原模擬表位的噬菌體至2.0×1011pfu，取0.5mg/ml的羊抗鼠IgG二抗，用XYZ三維點噴儀分別噴點于硝酸纖維素膜上，作為試紙條的檢測線和質控線，兩線間隔約為7mm，37℃干燥12h，備用；用K2CO3調1ml膠體金溶液至pH值為8.2，用蒸餾水稀釋抗恩諾沙星單克隆抗體至0.04mg/ml，然后緩慢加入膠體金溶液中，邊滴邊攪拌，攪拌反應1h后，加入100μl 1％PEG至溶液中，繼續攪拌30min；加入100μl 10％BSA溶液，攪拌30min，4℃8000rpm離心30min，棄上清，100μl重懸液重懸沉淀，4℃保存備用；將膠體金標記抗體復合物稀釋，用XYZ三維點噴儀將稀釋后的復合物噴涂于結合墊上，30℃干燥2h，備用；將硝酸纖維素膜、膠體金結合墊、樣品墊和吸水紙依次組裝在PVC底板上，用切刀切割成4mm寬的試紙條裝入檢測卡中，備用；將80μl樣品提取液加入試紙條加樣孔中，10min后觀察檢測結果。