[發明專利]一種透明質酸酶的制備方法

在審

• 申請號: 201810085468.3
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108220272A
• 公開（公告）日: 2018-06-29
• 發明（設計）人: 史政豪;徐國華;袁峰;趙伏梅
• 申請（專利權）人: 江蘇神華藥業有限公司
• 主分類號: C12N9/26
• 分類號: C12N9/26;C12R1/84
• 代理公司: 北京思創大成知識產權代理有限公司 11614
• 代理人: 尹慧晶

1.一種透明質酸酶的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)將透明質酸酶的生產菌種接入種子培養基中并培養至對數期；

(2)將步驟1)得到的種子液按10～15％的接種量接入發酵培養基，通入氧氣，控制溶氧20～50％、pH為5.3～5.5，在溫度為29.5～30.5℃的條件下進行發酵，細胞產量達到50～100g/L濕細胞；

(3)發酵結束后，開始流加濃度50％的甘油溶液，并在甘油溶液中添加PTM1，PTM1的添加量為10-15mL/L甘油；補料速度為16～20mL每小時每升初始發酵液體積，補料時間為10～14h，本階段完成后細胞產量達到180～220g/L濕細胞；

(4)進入甲醇誘導階段，終止甘油的補料并且開始用含10-15mL/L PTM1的甲醇進行誘導，設定補料速率為3.0～4.0mL/h每升初始發酵液體積，此補料速率維持1～3h；然后補加速率增加至7.0～8.0mL/h每升初始發酵液體積，維持2～4h；最后，增大甲醇流加速率至10～12mL/h每升初始發酵液體積，并保持至發酵過程結束。

2.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述透明質酸酶的生產菌種為重組畢赤酵母菌P.pastoris GS115/pPIC9K-His-HaseA3887。

3.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述種子培養基包括酵母抽提物9～11g/L，蛋白胨19～21g/L，葡萄糖19～21g/L。

4.根據權利要求3所述的制備方法，其特征在于，所述種子培養基包括酵母抽提物10g/L，蛋白胨20g/L，葡萄糖20g/L。

5.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，所述發酵培養基為甘油35～45g/L，K₂SO₄ 18～19g/L，MgSO₄·7H₂O 14～15g/L，KOH 4～5g/L，85％H₃PO₄ 26～27mL/L，CaSO₄·2H₂O 0.5～1.0g/L，PTM1微量元素4.35mL/L。

6.根據權利要求5所述的制備方法，其特征在于，所述發酵培養基包括甘油40g/L，K₂SO₄18.2g/L，MgSO₄·7H₂O 14.9g/L，KOH 4.13g/L，85％H₃PO₄ 26.7mL/L，CaSO₄·2H₂O 0.93g/L，PTM1微量元素4.35mL/L。

7.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(2)中所述的接種量為15％，溶氧控制在20～40％，pH為5.3～5.5、溫度30℃，發酵24h，這個階段所達到的細胞產量為70～80g/L濕細胞。

8.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(3)甘油補料速率為18.15mL每小時每升初始發酵液體積，并維持12個小時。

9.根據權利要求1所述的制備方法，其特征在于，步驟(4)設定最初的甲醇補料速率3.6mL/h每升初始發酵液體積，此補料速率維持2h；然后補料速率增加至7.3mL/h每升初始發酵液體積，此補料速率維持3h；最后，增大甲醇流加速率至10.9mL/h每升初始發酵液體積。

10.根據權利要求1～9任一項所述的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)挑取透明質酸酶生產菌單菌落于種子培養基中，在30℃、pH為6～8、200～220rpm的條件下培養24h；

(2)將步驟(1)得到的產物按15％接種量接入發酵培養基，通入氧氣，控制溶氧20～40％、pH為5.3～5.5，在溫度為29.5～30.5℃的條件下進行發酵，待甘油消耗殆盡，細胞產量達到70～80g/L濕細胞；

(3)發酵結束后，開始流加甘油溶液，并在甘油溶液中添加PTM1，PTM1的添加量為12mL/L甘油溶液；甘油補料速率為18.15mL每小時每升初始發酵液體積，并維持12個小時；本階段完成后細胞產量達到180～220g/L濕細胞；

(4)進入甲醇誘導階段，終止甘油溶液的補料，流加含有12mL/L PTM1的純甲醇進行誘導，甲醇在發酵液中的含量為1.8％；設定最初的甲醇補料速率3.6mL/h每升初始發酵液體積，此補料速率維持2h；然后補料速率增加至7.3mL/h每升初始發酵液體積，此補料速率維持3h；最后，增大甲醇流加速率至10.9mL/h每升初始發酵液體積至誘導結束。