[發明專利]茶樹壞死環斑病毒的全基因序列及其檢測方法

有效

• 申請號: 201810084968.5
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108165535B
• 公開（公告）日: 2020-12-01
• 發明（設計）人: 郝心愿;張偉富;王新超;楊亞軍
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院茶葉研究所
• 主分類號: C12N7/00
• 分類號: C12N7/00;C12N15/40;C12N15/11;C07K14/08;C12Q1/70;C12Q1/686;C12Q1/6851;C12R1/94
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 吳秉中

1.茶樹壞死環斑病毒，其特征在于，該茶樹壞死環斑病毒的基因組序列一共由4段組成，對應為TPNRBV-RNA1，TPNRBV-RNA2，TPNRBV-RNA3，TPNRBV-RNA4，每段末端均有長度不一的poly(A)結構，TPNRBV-RNA1的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，TPNRBV-RNA2的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，TPNRBV-RNA3的核苷酸序列如SEQ ID NO.5所示，TPNRBV-RNA4的核苷酸序列如SEQ ID NO.10所示。

2.用于檢測權利要求1所述茶樹壞死環斑病毒的特異性PCR引物，其特征在于，針對病毒基因組的4個片段對應設計了4對引物序列，包括針對TPNRBV-RNA1設計的TPNRBV1-F和TPNRBV1-R，針對TPNRBV-RNA2設計的TPNRBV2-F和TPNRBV2-R，針對TPNRBV-RNA3設計的TPNRBV3-F和TPNRBV3-R以及針對TPNRBV-RNA4設計的TPNRBV4-F和TPNRBV4-R， TPNRBV1-F的核苷酸序列為GCCCTGACAACGCAAAAGAACTGATG，TPNRBV1-R的核苷酸序列為GTGACGGGATATTTTTGGACGACTGT，TPNRBV2-F的核苷酸序列為GGGCCGGGGTGTGGAAAAACTT，TPNRBV2-R的核苷酸序列為TTCTTATCATCCCGGCAAAACACA，TPNRBV3-F的核苷酸序列為TTCGCCACTCACAAAGACACAACAAACT，TPNRBV3-R的核苷酸序列為GTAGCGGAGCGGAAAGAAAAGACT，TPNRBV4-F的核苷酸序列為TCAGTGGCGCGATTATCAGAAGGTA，TPNRBV4-R的核苷酸序列為CGCGCAAGAAGTCGGTCAAAAC。

3.檢測如權利要求1所述茶樹壞死環斑病毒的方法，其特征在于，利用權利要求2所述的引物進行普通定性PCR和熒光定量PCR檢測。

4.如權利要求3所述的檢測所述茶樹壞死環斑病毒的方法，其特征在于包括以下步驟：

A：提取病毒感染的茶樹葉片總RNA；

B：利用反轉錄試劑盒以簡并引物N25為合成引物，按照試劑盒要求合成cDNA模板；

C:將終產物稀釋到800 μl 后用于普通定性PCR檢測和熒光定量PCR檢測。

5.如權利要求4所述的檢測所述茶樹壞死環斑病毒的方法，其特征在于所述普通定性PCR檢測反應體系如下：2×PCR buffer 5μl，cDNA模板 2μl，20pm上游引物 0.25μl，20pm下游引物 0.25μl ，rTaq酶 0.2μl，ddH₂O 2.3μl；

反應程序為：95℃ 3 min；95℃ 15 s, 52℃ 15 s, 72℃ 30 s，共35個循環；72℃ 2min 后結束程序；

檢測方法為：向上述10 μl PCR反應產物中加入2 μL 6xloading buffer，混勻后用1%凝膠電泳檢測產物條帶，用100-1000 bp范圍的ladder作為片段大小對照標準。

6.如權利要求4所述的檢測所述茶樹壞死環斑病毒的方法，其特征在于所述熒光定量PCR反應體系如下：2×定量PCR 反應混合溶液 5μl，cDNA模板 4μl，20pm上游引物 0.25μl，20pm下游引物 0.25μl ，ddH₂O 0.5μl；

反應程序為： 95℃ 10 min；95℃ 20 s ，52℃ 10 s，70℃ 35 s，35個循環；溶解曲線檢測溫度65℃ -95℃ 。