[發明專利]評估水中污染物的神經性毒性的方法

在審

• 申請號: 201810084597.0
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108251508A
• 公開（公告）日: 2018-07-06
• 發明（設計）人: 任宗明;潘宏偉;任佰祥;喬琳琳;李尚戈;楊美怡
• 申請（專利權）人: 山東師范大學
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851
• 代理公司: 濟南圣達知識產權代理有限公司 37221
• 代理人: 鄭平

本發明提供評估水中污染物的神經性毒性的方法。包括：配制10％地表水濃度的溴氰菊酯溶液；選取適量的斑馬魚分別在曝氣水和10％地表水濃度的某污染物溶液中進行為期七天的連續暴露，分別即為空白組和實驗組；對上述空白組和實驗組的斑馬魚腦部進行解剖，提取總RNA、反轉錄成cDNA，并進行實時熒光定量PCR擴增；用2^－△△CT法對對實驗數據進行相對定量分析，并繪制折線圖，根據實驗結果評估水中污染物可能對毒蕈堿受體(M1受體)的功能的影響。步驟簡單、操作方便、實用性強。

技術領域

本發明屬于環境監測領域，涉及一種利用分子技術手段評估水污染對人體健康的潛在危害的方法。

背景技術

隨著斑馬魚基因組測序工作的完成，發現斑馬魚的基因與人類的基因的保守度高達85％，這使得斑馬魚成為一種研究人類疾病的模式動物，越來越受到人們的關注。同時，斑馬魚胚胎發育遺傳學技術的逐步建立和完善也為斑馬魚的人類疾病模型的和分析提供了良好的基礎。溴氰菊酯具有選擇毒性，相比鳥類和哺乳類等，魚類對溴氰菊酯的毒性更加敏感。因而，選擇斑馬魚作為監測對象，是個不錯的選擇。

目前，水質評估的方法多樣，如理化分析方法(如滴定、分光光度分析等)、現代儀器分析方法(色譜分析、光譜分析等)、生物監測法等。而且涉及的生命層次也比較廣泛，從群落到種群再到生物個體的研究比比皆是。而在分子層次評估水質變化，相對比較匱乏。值得注意的是，水中污染物的毒性效應，有的能即刻表現出來，有的潛伏期相對較長。這就需要從水生生物的內部生理變化反應水質的變化。

專利CN201510315920.7公開了一種雙抗夾心ELISA定量檢測方法，通過雙抗夾心法定量檢測斑馬魚M3a受體蛋白的含量并評估水質的變化。但由于雙抗夾心法檢測時間較長、難以做到及時、準確。

史慧勤的論文《藥物神經毒性評價斑馬魚模型的建立及氯胺酮神經發育毒性機制研究》應用RT-PCR法檢測亞麻劑量氯胺酮的斑馬魚中樞神經NMDA受體亞基表達情況，以評估斑馬魚幼魚神經發育毒性作用及劑量-行為效應機制。但由于NMDA受體亞基含量、分布范圍較窄，缺乏廣泛的適用性。

發明內容

為了克服上述問題，本申請針對現有水質評估中，關于溴氰菊酯毒性評估方法的不足，提出了一種利用M1受體的相對表達來評估水中污染物(溴氰菊酯毒性)對人類健康的潛在危害的方法。

M1受體是毒蕈堿型乙酰膽堿受體的一個亞型，在大腦中分布最為廣泛，占大腦皮層和海馬的40％-50％。M1受體與阿爾茨海默病(AD)關系密切。淀粉樣肽沉積物是阿爾茨海默病的特征之一，M1受體的激活能保護神經元免受淀粉樣肽(Ah)毒性。M1受體與認知過程有關，參與調節學習和記憶，保護細胞免受凋亡作用引起的損傷，包括DNA損傷、氧化應激和皮質中神經元線粒體的損傷。心肌細胞中也含有M1受體，且M1受體可導致心率的下降。利用M1受體與神經性疾病的密切關系。

為了實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種利用斑馬魚對水中污染物的神經性毒性的潛在風險進行評估的方法，包括：

配制10％地表水濃度的溴氰菊酯溶液；

選取適量的斑馬魚分別在曝氣水和10％地表水濃度的某污染物溶液中進行為期七天的連續暴露，分別即為空白組和實驗組；

對上述空白組和實驗組的斑馬魚腦部進行解剖，提取總RNA、反轉錄成cDNA，并進行實時熒光定量PCR擴增；

用2^－△△CT法對對實驗數據進行相對定量分析，并繪制折線圖，根據實驗結果評估水中污染物可能對毒蕈堿受體(M1受體)的功能的影響。