[發(fā)明專利]一種念珠菌屬真菌生物被膜胞外基質(zhì)的提取方法

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810083189.3
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108373979A
• 公開（公告）日: 2018-08-07
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 邵菁;汪天明;施高翔;段強軍;吳大強;笪文悅;汪長中;顏貴明
• 申請（專利權(quán)）人: 安徽中醫(yī)藥大學(xué)
• 主分類號: C12N1/16
• 分類號: C12N1/16;C12N1/00;C12N13/00;C12R1/72
• 代理公司: 蘇州翔遠(yuǎn)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32251
• 代理人: 王華

一種念珠菌屬真菌生物被膜胞外基質(zhì)的提取方法，包括成膜導(dǎo)管片的制得，以及將成膜導(dǎo)管片放于磷酸氫二鈉?磷酸二氫鈉緩沖液或Tris?HCl緩沖液中，接著先進(jìn)行渦旋震蕩，再進(jìn)行超聲處理，得到懸浮液；接下來將所述懸浮液與離子交換樹脂置于一容器內(nèi)進(jìn)行搖床孵育；用500mM的NACl溶液洗脫第三步得到的離子交換樹脂得到洗脫液，然后對所述洗脫液進(jìn)行搖床作用1.5~2.5小時，洗脫液經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾，離心后得到的上清液即為念珠菌屬真菌生物被膜胞外基質(zhì)提取液。本發(fā)明采用離子交換樹脂輔助提取的方法，應(yīng)用于常見的念珠菌屬生物被膜EPS的提取中，具有提取效率高的優(yōu)點。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種念珠菌屬真菌生物被膜胞外基質(zhì)的提取方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

念珠菌屬（Candida，CA）是一種人體黏膜表面常見的條件性病原真菌。近年來廣譜抗生素、醫(yī)用導(dǎo)管插管、侵入性手術(shù)、輻射化療等的廣泛應(yīng)用已經(jīng)造成CA發(fā)病率呈逐年上升趨勢，臨床死亡率更是高達(dá)40-60%。其中一個重要的原因是粘附在組織或植入性材料表面的CA可以分泌豐富的胞外多聚基質(zhì)（Extracellular polymeric substances，EPS），而由EPS和包裹其中的被膜菌共同構(gòu)成的生物被膜（biofilm）可以保護(hù)CA免于抗真菌藥物的攻擊和宿主免疫系統(tǒng)的識別，其中EPS被認(rèn)為起到了某種延遲藥物擴散滲透的作用，因此EPS被認(rèn)為是防治CA生物被膜的靶點之一。

EPS是CA生物被膜重要組成部分，但對于EPS組成的資料僅來自于世界上少數(shù)幾個實驗室。研究EPS的難點首先是缺乏有效便捷的提取手段，目前沒有標(biāo)準(zhǔn)的EPS提取程序，常用的提取方法包括離心、過濾、加熱、混合、超聲處理并配合絡(luò)合劑的使用等。英國蘇格蘭大學(xué)Douglas小組多年來致力于利用簡單的離心+緩沖液提取的方法研究EPS組成，他們發(fā)現(xiàn)白念珠菌生物被膜EPS含有約41%碳水化合物、16%葡萄糖、6%蛋白質(zhì)、4%氨基己糖、0.5%磷等，同時經(jīng)酶解后發(fā)現(xiàn)EPS主要成分對蛋白酶K、DNase I和溶壁酶敏感。然而從該小組的一系列報道中，我們可以發(fā)現(xiàn)①大約有20-40%提取出來的EPS無法鑒定其成分；②所采用的提取方法會漏掉EPS中不溶于水或微溶于水的成分。由于缺乏其他實驗室在這方面的研究資料，目前對于EPS的化學(xué)構(gòu)成仍有很多不確定性。因此，建立EPS有效的提取方法是分析EPS各組分在CA生物被膜中作用的首要前提。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于提供一種念珠菌屬真菌生物被膜胞外基質(zhì)的提取方法。

為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提供的技術(shù)方案是：一種念珠菌屬真菌生物被膜胞外基質(zhì)的提取方法，包括下列步驟：

第一步：首先用乙醇浸泡導(dǎo)管片使其無菌，然后將所述導(dǎo)管片取出后浸泡于無菌水中，接著將念珠菌屬的菌種活化，調(diào)整菌液濃度為1×10⁶CFU/mL；

第二步：將所述導(dǎo)管片置于所述菌液中，然后進(jìn)行搖床孵育，使菌種粘附于所述導(dǎo)管片上，接著取出所述導(dǎo)管片置于一容納有1640培養(yǎng)基的離心管中，于37℃恒溫靜置孵育20~28h，以形成生物被膜；

第三步：取出第二步得到的導(dǎo)管片，然后放于磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液或Tris-HCl緩沖液中，接著先進(jìn)行渦旋震蕩，再進(jìn)行超聲處理，得到懸浮液；接下來將所述懸浮液與離子交換樹脂置于一容器內(nèi)進(jìn)行搖床孵育；

第四步：用500mM的NACl溶液洗脫第三步得到的離子交換樹脂得到洗脫液，然后對所述洗脫液進(jìn)行搖床作用1.5~2.5小時，洗脫液經(jīng)0.22μm的微孔濾膜過濾，離心后得到的上清液即為念珠菌屬真菌生物被膜胞外基質(zhì)提取液。

優(yōu)選的技術(shù)方案為：所述離子交換樹脂為強酸性陽離子交換樹脂。

優(yōu)選的技術(shù)方案為：所述磷酸氫二鈉-磷酸二氫鈉緩沖液的pH值為5.8~7.8；所述Tris-HCl緩沖液的pH值為7.6~8.1。