[發(fā)明專利]一種PBMC細(xì)胞的凍存方法及復(fù)蘇方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810082387.8
• 申請(qǐng)日: 2018-01-29
• 公開（公告）號(hào): CN108094411A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 譚毅;張慧慧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東省齊魯細(xì)胞治療工程技術(shù)有限公司;銀豐生物工程集團(tuán)有限公司
• 主分類號(hào): A01N1/02
• 分類號(hào): A01N1/02;C12N5/078
• 代理公司: 山東舜天律師事務(wù)所 37226
• 代理人: 李新海

本發(fā)明公開了一種PBMC細(xì)胞的凍存方法，包括：(1)PBMC細(xì)胞離心得到細(xì)胞沉淀，重懸，滴加2×凍存液，維持細(xì)胞懸液的密度為2×107/ml，分裝到凍存管中；(2)放入程序降溫儀，逐漸降溫至?90℃后轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期保存。本發(fā)明還公開了一種PBMC細(xì)胞的復(fù)蘇方法，包括：(1)將保存有PBMC細(xì)胞的凍存管取出，迅速放入水浴中，反復(fù)震蕩5～15次，震蕩時(shí)間控制在3min以內(nèi)；(2)細(xì)胞懸液用X?VIVO無血清培養(yǎng)基洗滌，維持細(xì)胞密度在1～2×106/ml。本發(fā)明的凍存方法通過程序性降溫儀精確控制降溫速率，能有效避免冰晶的產(chǎn)生，降低細(xì)胞的損傷，顯著提高PBMC細(xì)胞凍存復(fù)蘇24h后的凍存復(fù)蘇活率。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種PBMC細(xì)胞的凍存方法及復(fù)蘇方法，屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域。

背景技術(shù)

外周血單個(gè)核細(xì)胞(Peripheralbloodmononuclearcell，PBMC)即外周血中具有單個(gè)核的細(xì)胞，包括淋巴細(xì)胞和單核細(xì)胞。即：非骨髓血中的單核造血干細(xì)胞、骨髓中的造血干細(xì)胞釋放到血液中，再從血液中提取分離得到造血干細(xì)胞，這樣得到的干細(xì)胞稱為外周血單個(gè)核細(xì)胞。體外檢測(cè)淋巴細(xì)胞首先要分離外周血單個(gè)核細(xì)胞，目前主要的分離方法是Ficoll-hypaque(葡聚糖－泛影葡胺)密度梯度離心法，因?yàn)檠褐懈饔行纬煞值谋戎卮嬖诓町悾虼说靡苑蛛x。紅細(xì)胞和粒細(xì)胞密度大于分層液，同時(shí)因紅細(xì)胞遇到Ficoll而凝集成串錢狀而沉積于管底。

免疫治療中使用的CIK，DC-CIK，NK，CAR-T等免疫細(xì)胞都從PBMC中通過不同的方式誘導(dǎo)而來，在細(xì)胞免疫治療領(lǐng)域具有重要的地位。然而新鮮分離的PBMC由于其細(xì)胞種類復(fù)雜，凍存和復(fù)蘇過程會(huì)顯著改變細(xì)胞的熱力學(xué)、化學(xué)和物理環(huán)境，有伴隨造成生物性損傷的危險(xiǎn)。因此，本領(lǐng)域需要有凍存、復(fù)蘇PBMC的簡(jiǎn)單、有效的方法，以滿足醫(yī)藥、科研、臨床應(yīng)用等領(lǐng)域的需求。

細(xì)胞凍存及復(fù)蘇的基本原則是慢凍快融，實(shí)驗(yàn)證明這樣可以最大限度的保存細(xì)胞活力。目前細(xì)胞凍存多采用甘油或二甲基亞砜作保護(hù)劑(實(shí)驗(yàn)證明二甲基亞砜更好)，這兩種物質(zhì)能提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，加上緩慢冷凍可使細(xì)胞內(nèi)的水分滲出細(xì)胞外，減少細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，從而減少由于冰晶形成造成的細(xì)胞損傷。復(fù)蘇細(xì)胞應(yīng)采用快速融化的方法，這樣可以保證細(xì)胞外結(jié)晶在很短的時(shí)間內(nèi)即融化，避免由于緩慢融化使水分滲入細(xì)胞內(nèi)形成胞內(nèi)再結(jié)晶對(duì)細(xì)胞造成損傷。

影響凍存復(fù)蘇活率的因素很多：凍存前的細(xì)胞質(zhì)量，凍存細(xì)胞濃度，凍存液的種類，凍存中的溫度控制，凍存復(fù)蘇時(shí)的實(shí)驗(yàn)操作等都會(huì)影響凍存復(fù)蘇活率。新鮮復(fù)蘇的PBMC細(xì)胞的凍存復(fù)蘇活率一般都在90％以上，但是24h之內(nèi)會(huì)有細(xì)胞出現(xiàn)凋亡，因此，細(xì)胞的凍存復(fù)蘇活率，很大程度上取決于細(xì)胞復(fù)蘇后的24h之內(nèi)的狀況。細(xì)胞凍存的方法在現(xiàn)有技術(shù)中采用最多的是利用程序性降溫盒置于超低溫冰箱中放置24～72h，再轉(zhuǎn)移至液氮中進(jìn)行長(zhǎng)期的保存。但程序性降溫盒在逐漸降溫的過程中無法精確控制降溫速率，會(huì)導(dǎo)致凍存液中形成較多的冰晶，導(dǎo)致細(xì)胞受到較大的損傷。程序性降溫儀作為可以由程序來控制溫度的儀器，在細(xì)胞凍存過程中必將發(fā)揮越來越重要的作用。然而程序性降溫儀的降溫曲線，特別是針對(duì)PBMC 的降溫曲線，并沒有被科研工作者所充分關(guān)注。

發(fā)明內(nèi)容

針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明為了解決上述問題，經(jīng)過深入的研究和創(chuàng)造性的勞動(dòng)，對(duì)比了凍存密度對(duì)凍存復(fù)蘇活率的影響，同時(shí)對(duì)比了常規(guī)使用的程序性降溫盒和各種降溫程序的程序性降溫儀用來凍存PBMC細(xì)胞對(duì)凍存復(fù)蘇活率的影響，找出了一種凍存復(fù)蘇活率最高的程序，為PBMC在免疫治療中的應(yīng)用提供基礎(chǔ)。

本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種PBMC細(xì)胞的凍存方法，包括以下步驟：