[發明專利]一種PBMC細胞的凍存方法及復蘇方法

在審

• 申請號: 201810082387.8
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108094411A
• 公開（公告）日: 2018-06-01
• 發明（設計）人: 譚毅;張慧慧
• 申請（專利權）人: 山東省齊魯細胞治療工程技術有限公司;銀豐生物工程集團有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02;C12N5/078
• 代理公司: 山東舜天律師事務所 37226
• 代理人: 李新海

1.一種PBMC細胞的凍存方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)全血中分離得到的PBMC細胞，離心，得到細胞沉淀，將胎牛血清逐滴加入沉淀中重懸細胞制成細胞懸液，然后將等體積的2×凍存液逐滴加入到細胞懸液中，維持細胞懸液的密度為2×107/ml，分裝到凍存管中；

所述2×凍存液，是通過以下方法制備得到的：將二甲基亞砜逐滴加入到胎牛血清中，并混勻，4℃存放，備用，胎牛血清與二甲基亞砜的體積比為：4～9:1；

(2)將上述凍存管放入程序降溫儀，逐漸降溫至-90℃后轉移至液氮中進行長期保存；所述程序降溫儀的降溫程序為：

4℃～-20℃，-0.3°/min；

-20℃～-40℃，-0.5°/min；

-40℃～-90℃，-5°/min；

-90℃，維持5min。

2.根據權利要求1所述的PBMC細胞的凍存方法，其特征在于：所述步驟(1)的操作過程在冰上進行。

3.根據權利要求1所述的PBMC細胞的凍存方法，其特征在于：所述胎牛血清與二甲基亞砜的體積比為：4:1。

4.一種PBMC細胞凍存液，其特征在于：由以下組分組成：按體積百分數，全細胞培養液或者胎牛血清90～95％；二甲基亞砜5～10％。

5.根據權利要求4所述的PBMC細胞凍存液，其特征在于：由以下組分組成：全細胞培養液或者胎牛血清90％；二甲基亞砜10％。

6.一種PBMC細胞的復蘇方法，其特征在于：包括以下步驟：

(1)將保存有PBMC細胞的凍存管從液氮中取出，迅速放入水浴中，水浴的溫度為37℃±1℃，將凍存管在水浴中反復震蕩5～15次，震蕩時間控制在3min以內，直至看到凍存管中只剩下一團冰晶后從水浴中取出；

(2)小心的將凍存管中融化的細胞懸液吸入離心管中，然后將預冷的X-VIVO無血清培養基逐滴加入到離心管中，預冷的X-VIVO無血清培養基的體積為細胞懸液的10倍；300g離心5min；倒掉培養基，重復用預冷的X-VIVO無血清培養基洗滌一次；洗滌后，向沉淀中加入X-VIVO無血清培養基，維持細胞密度在1～2×106/ml。

7.根據權利要求6所述的PBMC細胞的復蘇方法，其特征在于：所述震蕩時間控制在2min以內。

8.根據權利要求6所述的PBMC細胞的復蘇方法，其特征在于：所述凍存管，是指利用權利要求1或2或3的方法所得到的保存有PBMC細胞的凍存管。

9.一種計算PBMC細胞凍存復蘇活率的方法，其特征在于：4％臺盼藍染色，使臺盼藍的終濃度為1％，取20ul臺盼藍染色的PBMC混合液加入血球計數板，計算4個大方格之內的活細胞數和總細胞數，則24h后現有的活細胞總數＝(活細胞數/總細胞數)*細胞體積；PBMC細胞凍存復蘇24h后凍存復蘇活率＝24h后現有的活細胞總數/凍存前細胞數。