[發明專利]一種可視快速檢測食源性致病菌的試劑盒及其方法

在審

• 申請號: 201810081793.2
• 申請日: 2018-01-29
• 公開（公告）號: CN108486258A
• 公開（公告）日: 2018-09-04
• 發明（設計）人: 羅潔;孫璇;畢雙同;張鴻
• 申請（專利權）人: 南昌大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6844;C12Q1/04;C12Q1/6804;G01N33/543;C12R1/63;C12R1/42;C12R1/01
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 趙艾亮

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種可視快速檢測食源性致病菌的試劑盒及其方法，采用多重環介導等溫擴增結合膠體金免疫層析法同時檢測食品中副溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌三種食源性致病菌，其包括引物、LAMP擴增反應體系和膠體金免疫層析三重檢測試紙；本發明將LAMP的高靈敏度和膠體金免疫層析方法快速簡便的優點結合起來，同時檢測分析出三種食源性致病菌，實現對所擴增的目標核酸片段的特異性檢測，從而最終建立食源性致病菌的LAMP?膠體金免疫層析快速檢測鑒定的新方法。

技術領域

本發明涉及分子生物學技術領域，具體涉及一種可視快速檢測食源性致病菌的試劑盒及其方法。

背景技術

食源性致病菌在各種食品中的分布廣泛并且殘留量很低，因此建立相應的檢測方法并提高檢測準確性和檢測效率是保障食品安全，避免食源性疾病爆發的重要手段之一。食源性致病菌的檢測方法主要有培養法、免疫學法(如ELISA以及免疫層析試紙條法)、分子生物學法(如常規PCR、熒光定量PCR、恒溫擴增等方法)等。各種檢測方法均有各自的優勢和缺點：檢測方法繁瑣，檢測時間長，靈敏度低，容易發生漏檢和錯檢，傳統的檢測方法已無法滿足目前食品快速檢測的要求；相較于傳統培養法檢測食源性致病菌，基于免疫學和基于PCR的快速檢測方法更為快速、敏感性更好，由于儀器和試劑昂貴、需專業技術人員操作，以及PCR易污染等限制了這些方法的廣泛應用。

本發明為多重環介導等溫擴增(LAMP)結合膠體金免疫層析法檢測食源性病原菌。單管多重LAMP檢測方法，達到一次性快速檢測多種食源性致病菌的目的，而多重LAMP擴增產物不能像多重PCR那樣通過電泳或測序來判別其檢測體系中具體存在何種病原DNA，因此，本發明將環介導等溫擴增的高靈敏度和膠體金免疫層析方法快速簡便的優點結合起來，同時檢測分析出多種食源性致病菌，實現對所擴增的目標核酸片段的特異性檢測。LAMP-膠體金免疫層析法是一種靈敏度高、特異性強又簡便、直觀、經濟的食源性致病菌檢測方法，充分發揮分子生物學和免疫學兩種檢測方法的優長，大大提高了食源性致病菌的檢測效率和準確率。

發明內容

本發明的目的是提供一種可視快速檢測食源性致病菌的方法，該方法采樣多重環介導等溫擴增(LAMP)結合膠體金免疫層析法同時快速的檢測分析出三種食源性致病菌，充分發揮分子生物學和免疫學兩種檢測方法的優長，大大提高了食源性致病菌的檢測效率和準確率。

為實現上述目的，本發明采用的技術方案是：

本發明提供了一種可視快速檢測食源性致病菌的試劑盒，該試劑盒采用多重環介導等溫擴增結合膠體金免疫層析法同時檢測食品中副溶血性弧菌、沙門氏菌和單增李斯特菌三種食源性致病菌，其包括引物、LAMP擴增反應體系和膠體金免疫層析三重檢測試紙；

(1)引物：包括含FIP、BIP、F3、B3、LoopF和LoopB，其中BIP引物標記上FITC抗體，LoopB引物標記上熒光探針；

引物序列如下：

tlh-FIP：CTGTCACCGAGTGCAACCACTT-AACCACACGATCTGGAGCA；

tlh-BIP-FITC：GCATCACAATGGCGCTTCCC-ACCGTTGGAGAAAGTGACCTA，5’端標記熒光素；

tlh-F3：CGCTGACAATCGCTTCTCAT；

tlh-B3：GTTCTTCGCTTTGGCAATGT；

tlh-LF：CTGCATTGCTGCGTCGT；

tlh-LB-Bio：TAACCCGAACAGCTGGTTCT，5’端標記生物素；

invA-FIP：GCATCCGCATCAATAATACCG-CTCTGGATGGTATGCCCGG；