[發(fā)明專利]一種玉米AGPase磷酸化鑒定方法

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810078511.3
• 申請日: 2018-01-26
• 公開（公告）號: CN108218991B
• 公開（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設計）人: 余國武;黃玉碧;呂亞楠;張軍杰;劉漢梅;胡育峰;劉應紅
• 申請（專利權）人: 四川農業(yè)大學
• 主分類號: C07K16/40
• 分類號: C07K16/40;C07K16/06;G01N33/531;G01N33/573
• 代理公司: 北京眾合誠成知識產權代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

本發(fā)明公開了一種玉米AGPase磷酸化鑒定方法，涉及生物化學與分子生物學領域，步驟為：AGPase亞基蛋白Sh2和Bt2抗體的制備，AGPase亞基Sh2和Bt2抗體的特異性驗證，授粉后15天、20天和27天玉米胚乳蛋白的提取，授粉后15天、20天和27天玉米胚乳磷酸化蛋白的富集，授粉后15天、20天和27天玉米籽粒磷酸化蛋白的檢測和驗證；本發(fā)明在制備好抗體后，結合Phos?tag技術具有快速確定AGPase酶是否發(fā)生磷酸化的優(yōu)勢，并且不需要進行質譜，因而成本低。并且此方法只要有特異的相應蛋白抗體，具有推廣到鑒定任意一種蛋白磷酸化的鑒定上，因此具有蛋白質磷酸化鑒定的廣泛應用。

技術領域

本發(fā)明公開了玉米淀粉合成的關鍵酶腺苷二磷酸葡萄糖焦磷酸化酶（AGPase）磷酸化的鑒定方法，涉及生物化學與分子生物學領域。

背景技術

蛋白質的磷酸化是指蛋白質在激酶的作用下，將ATP或GTPγ位的磷酸基轉移到底物蛋白質氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸和酪氨酸）上的過程，是生物體內一種蛋白功能最有效的調節(jié)方式。同時，蛋白質的去磷酸化是在磷酸酶的作用下，去掉磷酸基團的過程。蛋白的磷酸化和去磷酸化是一個可逆的過程。蛋白質的磷酸化是目前研究最廣泛的蛋白質翻譯后修飾之一，在生物的生長發(fā)育過程中起著非常關鍵的作用，幾乎參與了所有的生物學過程，比如生物的代謝調控、基因表達調控、對外界環(huán)境的響應和細胞的信號轉導等過程。有研究表面在生物體內約有三分之一的蛋白質發(fā)生磷酸化修飾，因此蛋白質磷酸化鑒定對蛋白質的功能研究顯得非常重要。

植物磷酸化蛋白質的富集與鑒定技術，是蛋白質磷酸化鑒定的關鍵。盡管在生物體內約有三分之一的蛋白質發(fā)生了磷酸化，但單個磷酸化蛋白在總蛋白中的占比比較小，相對含量比較低，因此直接鑒定單個蛋白的磷酸化比較困難。蛋白質磷酸化鑒定的前提是蛋白的分離與富集。目前對磷酸化蛋白質的富集技術主要有³²P放射性標記法、特異性抗體的免疫共沉淀、熒光染料染色和色譜分離等技術。

³²P放射性標記法。該方法利用³²P放射性同位素示蹤標記蛋白質氨基酸上的磷酸基團，從而確定蛋白質磷酸化修飾的狀態(tài)。Khan運用γ ³²P標記分析GA處理下水稻葉鞘中的磷酸化蛋白，鑒定出了44個發(fā)生磷酸化修飾的蛋白質。由于³²P放射性標記法具有放射性，實驗操作要求高，因此今年報道較少。

免疫共沉淀法。該方法用磷酸化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸和磷酸化酪氨酸的特異抗體先后進行免疫共沉淀。蛋白質電泳分離蛋白質條帶，膠上酶解后進行質譜分析鑒定。應用此方法Rush等富集了4中細胞的600多個酪氨酸磷酸化肽段，其中磷酸化位點約559個。因磷酸化絲氨酸和蘇氨酸抗體的抗原決定簇較小，免疫共沉淀較為困難，且磷酸化絲氨酸、磷酸化蘇氨酸和磷酸化酪氨酸的特異抗體獲得較困難，因此報道也比較少。

熒光染料染色法（Pro-Q diamond phosphoprotein stain,Pro-Q DPS）。Pro-Q可高效地與磷酸化的氨基酸殘基結合，采用蛋白質電泳技術對組織細胞總蛋白進行分離，然后用Pro-Q對蛋白膠進行染色，只有磷酸化蛋白才會結合Pro-Q而顯色。Agrawa等鑒定出了在油菜籽粒發(fā)育不同階段均發(fā)生磷酸化修飾的70個蛋白質。

固相金屬離子親和色譜(immobilized metal affinity chromatography,IMAC)。1975年Porath提出該方法，其原理是磷酸化蛋白質會與IMAC硅脂柱上的固相化金屬離子（Ga²⁺或 Fe³⁺）通過靜電作用結合，然后先洗脫非磷酸化的雜志，最后富集和分離出磷酸化蛋白質。但該方法也存在多個磷酸化位點較難洗脫，有非特異結合等缺陷。