[發(fā)明專利]一種玉米AGPase磷酸化鑒定方法

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 201810078511.3
• 申請(qǐng)日: 2018-01-26
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN108218991B
• 公開(kāi)（公告）日: 2020-08-18
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 余國(guó)武;黃玉碧;呂亞楠;張軍杰;劉漢梅;胡育峰;劉應(yīng)紅
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 四川農(nóng)業(yè)大學(xué)
• 主分類號(hào): C07K16/40
• 分類號(hào): C07K16/40;C07K16/06;G01N33/531;G01N33/573
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 夏艷

1.一種玉米AGPase磷酸化鑒定方法，其特征在于，包括如下順序的步驟：

（1）通過(guò)基因克隆、原核表達(dá)載體構(gòu)建、蛋白誘導(dǎo)表達(dá)和純化及動(dòng)物的免疫和血清的分離制備AGPase亞基蛋白Sh2和Bt2抗體；

（2）采用Western blot檢測(cè)AGPase亞基Sh2和Bt2抗體的特異性；

（3）取材玉米高淀粉自交系08-641授粉后15天、20天和27天的玉米籽粒胚乳，在液氮中研磨至粉末，稱重；以1g/3mL的比例加入相應(yīng)的裂解液，并加入蛋白酶抑制劑，混勻，放置冰上30 min；在4℃下12000 rpm離心15 min，吸取上清于新的離心管，12000 rpm離心5 min，吸取上清；在3 mL反應(yīng)液中加入6 μL的上清，測(cè)OD₅₉₅值，計(jì)算蛋白濃度；

（4）取上步獲得的蛋白，利用Phos-tag小磁珠富集結(jié)合磷酸化蛋白，經(jīng)過(guò)雜蛋白洗滌，洗脫磷酸化蛋白；

（5）利用制備的AGPase酶大小亞基抗體，將洗脫的磷酸化蛋白SDS-PAGE凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，大小亞基一抗雜交，曝光檢測(cè)是否有條帶判斷AGPase酶大小亞基是否發(fā)生磷酸化；再取玉米胚乳裂解總蛋白10 μg，加堿性磷酸酶4 μL和2 μL 10×堿性磷酸酶buffer，加蛋白裂解液將總體積調(diào)為20 μL,37℃下反應(yīng)3 h,再Phos-tag富集，洗脫磷酸化蛋白，電泳后轉(zhuǎn)膜，牛奶封閉，Western blot雜交，驗(yàn)證Sh2和Bt2是否去磷酸化，從而證明是否發(fā)生磷酸化。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，基因克隆時(shí)，Bt2基因所用上游引物序列為：‘5-CGGGATCCATGGACATGGCTTTGGCGTC-3’，下游引物序列為：‘5-CAGTCGACTCATATAACTGTTCCACTAG-3’；Sh2基因所用上游引物序列為：‘5-CGGGATCCATGCAGTTTGCACTTGCATTG-3’，下游引物序列為：‘5-CACTCGAGCTATATGACAGACCCATCGTTG-3’。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的方法，其特征在于：步驟（1）中，基因克隆時(shí)，PCR反應(yīng)程序?yàn)?5℃、3 min，98℃、10 s、55℃、30 s、68℃、45 s、34個(gè)循環(huán)，72℃、10 min。