[發明專利]一種檢測阿米巴的PCR引物及方法

有效

• 申請號: 201810077844.4
• 申請日: 2018-01-26
• 公開（公告）號: CN108018367B
• 公開（公告）日: 2020-07-17
• 發明（設計）人: 謝永平;李軍;吳翠蘭;潘艷;秦若甫
• 申請（專利權）人: 廣西壯族自治區獸醫研究所
• 主分類號: C12Q1/6893
• 分類號: C12Q1/6893;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 南寧啟創知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 45122
• 代理人: 謝美萱

本發明公開了一種檢測阿米巴的PCR引物及方法。該PCR引物包括amb?F:CGGACGGCTCATTATAACAGT，amb?R:TCCCGTTATTTTCTGAATCACC。其擴增片段為16S rRNA，擴增長度為790bp。檢測方法包括(1)提取待檢樣品的DNA；(2)對待檢樣品進行PCR擴增反應；(3)對PCR擴增產物進行電泳檢測。本發明的方法具有檢測快速，特異性強等優點，為簡便、快速地檢測阿米巴原蟲帶來便利。

技術領域

本發明涉及微生物檢測技術領域，具體說是涉及一種檢測阿米巴原蟲的PCR引物組及方法。

背景技術

阿米巴原蟲病主要是由溶組織內阿米巴(Entamoeba histolytica)引起的一種高發病率、高度致病性的人獸共患寄生性原蟲病。該原蟲多寄生于人和動物的腸道和肝臟，引發阿米巴痢疾或肝膿腫。臨床上表現發熱、腹痛腹脹、嘔吐、惡臭痢疾血便等癥狀，病理剖解多見腸炎、腸道出血水腫、潰瘍、增生等，個別病例肝臟上出現膿腫。阿米巴原蟲病分布范圍廣泛，易感動物較多，呈世界性流行傳播。自1875年Feder Lo sch首次在人體發現該原蟲以來，該病已給人和動物的健康帶來了嚴重的影響，同時也造成了巨大的經濟損失。比如食蟹猴等動物被阿米巴原蟲感染，不僅給養殖業帶來經濟損失，還嚴重影響動物質量和動物跟蹤研究檢測結果的準確性，同時威脅動物飼養人員、獸醫工作者及相關密切接觸人群身體健康，因此快速的檢測出阿米巴原蟲感染情況，及時控制清除病原，保持動物的清潔，具有重要的公共衛生意義和研究意義。

溶組織內阿米巴以滋養體和包囊兩種存在形式。滋養體大小為7um～60um，形態多變，其胞質分內外兩層，內質較濃密呈顆粒狀，外質透明，運動時外質伸出，形成偽足，能做定向運動，細胞核呈泡狀，核膜薄，核仁細小，居中或偏離中心。包囊多呈球形,直徑為10um～16um，未染色時為一折光性圓形小體，碘染色后呈黃色，外周包圍一層透明的囊壁，內含1個～4個核,每個核具有1個位于中央的核仁。未成熟包囊，有1個～2個核，常見含有染成棕色的糖原泡和透明的桿狀擬染色體；成熟包囊具有4個核，糖原泡和擬染色體不易見到。目前用于實驗動物原蟲檢測還是采用糞便涂片或沉淀染色法等傳統檢測手段，如GB/T18448.9,GB/T 18448.10，這些方法雖然要求設備儀器不高，但由于原蟲體積較小，常常受雜質影響較大，顯微鏡檢查時檢出率較低；染色法需要配制試劑種類多，步驟繁瑣，要求顯微鏡操作者非常熟悉各類原蟲及卵囊形態，具有超強辨別能力和較好的視力，否則受人為因素影響較大。對于大批量的樣品檢測，需要大量的人力物力，特別是顯微鏡觀察者眼睛極易疲勞，難以在短時間內完成大量檢測樣品的工作。

因此利用現代新的分子生物學知識和新儀器設備研究開發新的快速檢測原蟲病方法，制定出操作規程或標準，非常迫切。

發明內容

本發明的目的是提供一種檢測阿米巴的PCR引物及方法，能夠更為簡便、快捷的檢測阿米巴原蟲，而且該方法的特異性強、靈敏性高、對模板的純度要求不高，適用性好。

一種檢測阿米巴的PCR引物為：

amb-F:CGGACGGCTCATTATAACAGT，

amb-R:TCCCGTTATTTTCTGAATCACC。

本發明的引物是基于溶組織內阿米巴序列設計的，其擴增片段為16S rRNA，擴增完之后長度為790bp。

本發明的檢測阿米巴的非疾病診斷目的的方法采用本發明的PCR引物來檢測阿米巴原蟲，具體檢測過程包括如下步驟：

(1)提取待檢樣品的DNA；

(2)對待檢樣品進行PCR擴增反應；先建立PCR反應體系，以每25μL體積為計：