[發明專利]硝呋太爾制霉素陰道軟膠囊的微生物限度檢查方法

在審

• 申請號: 201810077334.7
• 申請日: 2018-01-26
• 公開（公告）號: CN108315384A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發明（設計）人: 翟衛東;張靜
• 申請（專利權）人: 北京朗依制藥有限公司
• 主分類號: C12Q1/18
• 分類號: C12Q1/18
• 代理公司: 青島發思特專利商標代理有限公司 37212
• 代理人: 任永哲

1.一種硝呋太爾制霉素陰道軟膠囊的微生物限度檢查方法，其特征在于步驟如下：

(1)菌液制備

分別制備金黃色葡萄球菌菌懸液、銅綠假單胞菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液、白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液；

(2)供試液制備

稱取硝呋太爾制霉素陰道軟膠囊供試品10g，用無菌剪刀剪碎置于無菌均質袋中，加80ml的43℃無菌十四烷酸異丙酯，用均質器拍打1min，倒入無菌三角瓶中，膠囊殼留在無菌均質袋中加入50ml的43℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液用手把膠囊殼揉碎，再倒入三角瓶中震搖后，加入43℃pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液350ml震搖靜置5分鐘，用無菌注射器吸取上層十四烷酸異丙酯和供試品混合的溶液棄去，再用無菌注射器加無菌溶出儀針取水層240-260ml移入無菌三角瓶中，作為1：40的供試液；

(3)需氧菌、霉菌和酵母菌總數的測定

①試驗組：取1:40供試液1ml，置43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，經薄膜過濾法處理，在最后一次過濾時分別加入金黃色葡萄球菌菌懸液、銅綠假單胞菌菌懸液、枯草芽孢桿菌菌懸液、白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液，取下濾膜貼于胰酪大豆胨瓊脂培養基上置30-35℃培養箱中培養3天；另外再將分別加入白色念珠菌菌懸液和黑曲霉孢子懸液的濾膜貼于沙氏葡萄糖瓊脂培養基上置20-25℃培養箱中培養5天；

②菌液組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替供試液，按試驗組操作加入菌液，測定所加的菌液的菌數；

③供試品組：取制備好的供試液，以pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液代替菌液，其他同試驗組操作；胰酪大豆胨瓊脂培養基上置30-35℃培養箱中培養5天；沙氏葡萄糖瓊脂培養基上置20-25℃培養箱中培養7天；

④培養后進行需氧菌、霉菌和酵母菌總數的測定，

試驗組菌落數減去供試品組菌落數的值與菌液組菌落數的比值在0.5～2范圍內即為合格；

(4)控制菌的檢查

①金黃色葡萄球菌的檢查

供試品組：取1：40供試液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，用薄膜過濾器全部過濾，加入100mlTSB培養基，混勻，30～35℃培養18～24小時，得到培養物；取上述培養物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72小時；若平板上沒有菌落或鑒定結果為陰性，判定供試品未檢出金黃色葡萄球菌；

陽性對照組：取1：40供試液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，用薄膜過濾器全部過濾加入100mlTSB培養基，加入金黃色葡萄球菌混勻，30～35℃培養18～24小時，得到培養物；取上述培養物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72小時；若平板上沒有菌落或鑒定結果為陰性，判定陽性對照組未檢出金黃色葡萄球菌；

陰性對照組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，用薄膜過濾器全部過濾，加入100mlTSB培養基，混勻，30～35℃培養18～24小時，得到培養物；取上述培養物劃線接種于甘露醇氯化鈉瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72小時；若平板上沒有菌落或鑒定結果為陰性，判定陰性對照組未檢出金黃色葡萄球菌；

②銅綠假單胞菌的檢查

供試品組：取1：40供試液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，用薄膜過濾器全部過濾，加入100mlTSB培養基，混勻，30～35℃培養18～24小時，得到培養物；取上述培養物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72小時；若平板上沒有菌落或鑒定結果為陰性，判定供試品未檢出銅綠假單胞菌；

陽性對照組：取1：40供試液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，用薄膜過濾器全部過濾，加入100mlTSB培養基中，加入銅綠假單胞菌混勻，30～35℃培養18～24小時，得到培養物；取上述培養物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72小時；若平板上沒有菌落或鑒定結果為陰性，判定陽性對照組未檢出銅綠假單胞菌；

陰性對照組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，用薄膜過濾器全部過濾，加入100mlTSB培養基中，混勻，30～35℃培養18～24小時，得到培養物；取上述培養物劃線接種于溴化十六烷基三甲銨瓊脂培養基平板上，30～35℃培養18～72小時；若平板上沒有菌落或鑒定結果為陰性，判定陰性對照組未檢出銅綠假單胞菌；

③白色念珠菌的檢查

供試品組：取供試液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，用薄膜過濾器全部過濾，加入500ml沙氏葡萄糖液體培養基中，混勻，30～35℃培養3～5天，得到培養物；取上述培養物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，30～35℃培養24～48小時；若平板上沒有菌落或鑒定結果為陰性，判定供試品未檢出白色念珠菌；

陽性對照組：取供試液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，用薄膜過濾器全部過濾，加入500ml沙氏葡萄糖液體培養基中，加入白色念珠菌混勻，30～35℃培養3～5天，得到培養物；取上述培養物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，30～35℃培養24～48小時；若平板上沒有菌落或鑒定結果為陰性，判定陽性對照組未檢出白色念珠菌；

陰性對照組：取pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液40ml加入到43℃含3％聚山梨酯80和0.3％大豆卵磷脂的pH7.0無菌氯化鈉-蛋白胨緩沖液500ml中，用薄膜過濾器全部過濾，加入500ml沙氏葡萄糖液體培養基中，混勻，30～35℃培養3～5天，得到培養物；取上述培養物劃線接種于沙氏葡萄糖瓊脂培養基平板上，30～35℃培養24～48小時；若平板上沒有菌落或鑒定結果為陰性，判定陰性對照組未檢出白色念珠菌。