[發(fā)明專利]定量檢測游離DNA的方法、應(yīng)用及檢測游離DNA的試劑盒

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 201810076733.1
• 申請日: 2018-01-26
• 公開（公告）號: CN108315393A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 賀欣;劉強(qiáng);樊賽軍;董輝;郝建秀
• 申請（專利權(quán)）人: 中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院放射醫(yī)學(xué)研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6886;C12Q1/6876
• 代理公司: 北京智匯東方知識產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11391
• 代理人: 康正德;陳智勇

本申請涉及DNA檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法、應(yīng)用及檢測游離DNA的試劑盒。所述方法包括以下步驟：步驟一：制備PCR擴(kuò)增反應(yīng)模板：取待測外周血，離心后取上層血清，經(jīng)再次離心處理后取上層血清與孵育液混合，經(jīng)孵育、變性后于低溫下離心，取上清液作為模板；步驟二：PCR擴(kuò)增反應(yīng)：以步驟一模板進(jìn)行熒光定量PCR擴(kuò)增反應(yīng)，檢測擴(kuò)增產(chǎn)物，計算游離DNA的含量。

技術(shù)領(lǐng)域

本申請涉及DNA檢測技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及一種定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法、應(yīng)用及檢測游離DNA的試劑盒。

背景技術(shù)

循環(huán)游離DNA(circulating cell free DNA，cfDNA)是指循環(huán)血中游離于細(xì)胞之外的DNA，目前cfDNA在醫(yī)學(xué)領(lǐng)域主要應(yīng)用于以下三個方面：產(chǎn)前診斷、免疫性疾病的病情分析與療效觀察和腫瘤相關(guān)分析。

血清或血漿cfDNA的大小在166bp左右，其釋放入血的生物機(jī)制尚未被完全揭示，目前認(rèn)為主要來自細(xì)胞凋亡，其他來源包括壞死腫瘤細(xì)胞的溶解、白細(xì)胞的分解、新合成核酸的自主釋放、細(xì)菌病毒等病原體的分解等。cfDNA在血液與蛋白質(zhì)或膜結(jié)合顆粒形成天然復(fù)合物，能抵抗核酸酶的降解。正常健康人群的cfDNA水平較低，一般在0～100ng/mL，但在某些病理情況下會顯著升高，比如惡性腫瘤、手術(shù)和創(chuàng)傷、中風(fēng)、心衰、自身免疫性疾病、胰腺炎、重癥監(jiān)護(hù)相關(guān)狀況、運(yùn)動員大量訓(xùn)練后等。癌癥患者與健康個體相比有較高的cfDNA水平。這些升高的cfDNA主要來自癌細(xì)胞。近年來，隨著DNA提取、檢測、測序等分子生物學(xué)技術(shù)發(fā)展，使得cfDNA的研究取得了長足進(jìn)步，與疾病之間的關(guān)系逐漸被揭示出來。cfDNA作為生物標(biāo)志物，在疾病篩查、診斷、治療監(jiān)控、預(yù)后、疾病復(fù)發(fā)等方面具有廣泛應(yīng)用。

但cfDNA的濃度及組成始終是一個動態(tài)過程，cfDNA是蛋白質(zhì)結(jié)合DNA，其半衰期較短，半衰期從幾分鐘到2h不等，檢測的可靠性是其后續(xù)應(yīng)用的基本保障，關(guān)系到其作為生物標(biāo)志物的應(yīng)用前景，然而目前cfDNA的檢測仍然存在諸多問題，從采用血清還是血漿標(biāo)本的爭議，到標(biāo)本采集流程、檢測方法、結(jié)果判讀、正常值等均缺乏統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，各實(shí)驗(yàn)室之間的結(jié)果沒有可比性。對cfDNA檢測的規(guī)范和標(biāo)準(zhǔn)化，是cfDNA走向?qū)嶋H應(yīng)用的必然要求。目前cfDNA檢測的常用方法有實(shí)時熒光定量PCR(qPCR)法、熒光染料法、bDNA技術(shù)等。檢測目標(biāo)大概可分為cfDNA總濃度的檢測和其中一部分DNA的檢測。

在選擇檢測標(biāo)本方面，血漿或血清均可作為cfDNA提取及檢測的樣本，但兩者的cfDNA濃度和成分存在差異。目前認(rèn)為，由于凝血過程中白細(xì)胞溶解，釋放DNA入血，因此血清cfDNA總濃度高于血漿。從避免白細(xì)胞基因組DNA混入待測標(biāo)本的角度考慮，采用血漿標(biāo)本研究更加合理，也被采用較多。血液存放時間也會對cfDNA濃度產(chǎn)生影響。有研究顯示，血漿cfDNA在8h內(nèi)沒有變化，但血清cfDNA濃度在4h時增加，并隨時間延長持續(xù)增加。因此血漿分離前，抗凝全血在4℃的最大存放時間是8h，而血清應(yīng)立刻分離以避免基因組DNA的污染。EDTA抗凝全血在加入細(xì)胞膜穩(wěn)定劑的情況下，室溫放置0、3、6d后離心取血漿，cfDNA濃度未見明顯變化。細(xì)胞膜穩(wěn)定劑的加入可以有效抑制血細(xì)胞溶解，釋放DNA入血。血液存放的時間對cfDNA水平確實(shí)產(chǎn)生影響。因此，在條件允許的情況下，采血后最好立刻分離血漿或血清，避免外源DNA的混入及濃度波動，最大程度地反映cfDNA的原貌。

多數(shù)qPCR的定量研究面臨的第一個問題通常為提取cfDNA，然后進(jìn)行qPCR定量。這樣會造成cfDNA的損失，不僅在cfDNA總量上的損失不易被測量，而且，cfDNA片段的大小分布也會由于提取步驟的操作難以完全一致和物理材料吸附性質(zhì)不同而造成很大偏差。目前，血漿或血清cfDNA的提取普遍采用商業(yè)化試劑盒。由于cfDNA濃度極低，提取困難，不同方法提取效率差異明顯。