[發(fā)明專利]定量檢測游離DNA的方法、應用及檢測游離DNA的試劑盒

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• 申請?zhí)枺?/td>: 201810076733.1
• 申請日: 2018-01-26
• 公開（公告）號: CN108315393A
• 公開（公告）日: 2018-07-24
• 發(fā)明（設計）人: 賀欣;劉強;樊賽軍;董輝;郝建秀
• 申請（專利權）人: 中國醫(yī)學科學院放射醫(yī)學研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;C12Q1/6886;C12Q1/6876
• 代理公司: 北京智匯東方知識產(chǎn)權代理事務所(普通合伙) 11391
• 代理人: 康正德;陳智勇

1.一種定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法，其特征在于，包括以下步驟：

步驟一：制備PCR擴增反應模板：取待測外周血，離心后取上層血清，經(jīng)再次離心處理后取上層血清與孵育液混合，繼續(xù)加入蛋白酶K，使所述蛋白酶K的濃度為0.04～4mg/ml，經(jīng)孵育、高溫變性后于驟冷并在低溫下離心，取上清液作為模板；

步驟二：PCR擴增反應：以步驟一模板進行熒光定量PCR擴增反應，檢測擴增產(chǎn)物，基于擴增產(chǎn)物的熒光值計算待測血漿或血清中游離DNA的含量。

2.根據(jù)權利要求1所述的定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法，其特征在于，經(jīng)再次離心處理后得到的上清液與所述孵育液的體積比為3：1～1：1。

3.根據(jù)權利要求1所述的定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法，其特征在于，所述孵育液包括質量濃度為8％的十二烷基硫酸鈉、80mmol/L的三羥甲基氨基甲烷和2mmol/L的乙二胺四乙酸。

4.根據(jù)權利要求1所述的定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法，其特征在于，所述孵育液包括體積濃度5％的吐溫20、80mmol/L的三羥甲基氨基甲烷和2mmol/L的乙二胺四乙酸。

5.一種權利要求1～4任一項所述的定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法在檢測孕婦外周血游離胎兒DNA中的應用。

6.根據(jù)權利要求5所述的定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法在檢測孕婦外周血游離胎兒DNA中的應用，其特征在于，用于識別SRY基因和RhD基因；所述的定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法中，PCR擴增引物的上游引物為序列表SEQ ID NO.1所示引物，下游引物為序列表SEQ ID NO.2所示引物。

7.一種權利要求1～4任一項所述的定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法在檢測外周血腫瘤標志物DNA中的應用。

8.根據(jù)權利要求7所述的定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法在檢測外周血腫瘤標志物DNA中的應用，其特征在于，用于定量檢測人外周血中Alu基因和L1PA2基因；基因ALU247-F的引物為序列表SEQ ID NO.3所示引物；基因ALU247-R的引物為序列表SEQ IDNO.4所示引物；基因ALU115-F的引物為序列表SEQ ID NO.5所示引物；基因ALU115-R的引物為序列表SEQ ID NO.6所示引物；基因L1PA2-F的引物為序列表SEQ ID NO.7所示引物；基因LIPA2 90-R的引物為序列表SEQ ID NO.8所示引物；基因LIPA2 222-R的引物為序列表SEQID NO.9所示引物。

9.一種權利要求1～4所述的定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法在檢測基因數(shù)量和完整度中的應用。

10.一種檢測游離DNA的試劑盒，其特征在于，包括采用權利要求1～4任一項所述的定量檢測血漿或血清中游離DNA的方法的步驟制備得到。