[發明專利]豬鏈球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中應用

有效

• 申請號: 201810076108.7
• 申請日: 2018-01-26
• 公開（公告）號: CN108410784B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 張安定;徐磊;林嵐;呂偉華;韓麗
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平;馮超

本發明公開了一種豬鏈球菌△CPS/SsnA?mSly(P353L)?SC19工程菌及在疫苗中應用，該菌株以豬鏈球菌2型強毒分離株SC19為出發菌株，通過同源重組的方式，敲除了毒力基因cps和ssna，并將溶血素基因的353氨基酸由P突變成L，構建成功△CPS/SsnA?mSly(P353L)?SC19。菌株△CPS/SsnA?mSly(P353L)?SC19的致病力顯著降低，作為滅活疫苗和弱毒疫苗菌株時，具有很好的安全性，免疫動物后可提供針對豬鏈球菌2型、7型等血清型菌株感染的保護效力。而且該疫苗免疫后不會產生針對SsnA的抗體，該菌株可作為區分疫苗免疫動物和野毒感染動物的基因標記疫苗的菌株，從而有利于該病的根除和凈化。

技術領域

本發明涉及獸用生物制品技術領域，具體地指一種豬鏈球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中應用。

背景技術

豬鏈球菌病是由多種致病性鏈球菌引起的一種人畜共患的急性熱性傳染病。主要病原為豬鏈球菌(Streptococcus suis)，包含眾多血清型，已經定型的有33種，還有一些不能定型的菌株，各血清型之間缺少交叉免疫保護。導致現有市場上的滅活疫苗通常只針對特定的血清型，而無法預防多種血清型的感染。因此，開發具有廣泛的能夠預防多種血清型豬鏈球菌感染的疫苗，具有十分必要的價值和意義。

現有的研究結果表明血清型的不同主要取決于鏈球菌的莢膜成分。在豬鏈球菌的感染過程中，莢膜也能幫助鏈球菌逃避宿主免疫系統的攻擊。因此，將莢膜成分缺失，暴露豬鏈球菌的菌體表面成分，既能避免由莢膜造成的免疫逃逸的問題，又可將多種血清型共有的抗原更好的暴露，從而增強針對共有的菌體成分的免疫應答。因此，缺失莢膜將可以顯著降低致病力的同時達到預防多種血清型感染的目的。

豬鏈球菌感染過程中會分泌核酸酶SsnA，能分解粒細胞形成具有保護作用的胞外誘捕網(NET)，從而逃避宿主的天然殺傷作用。因此，缺失ssna基因可以顯著降低細菌的致病力，提高其作為弱毒疫苗菌株的安全性。同時，分泌核酸酶的菌株感染會刺激動物機體產生SsnA的抗體，而缺失菌株免疫后不會產生該抗體。因此利用該菌株免疫的動物，就可通過檢測SsnA的抗體來區分疫苗免疫和天然感染動物，從而有利于該病的控制和凈化。

溶血素是豬鏈球菌重要的毒素，同時也具有很好的免疫保護效力。將溶血素基因缺失后，可使其致病力顯著降低，但也會影響其介導的免疫應答反應。因此，研制一種既降低溶血素毒性又不影響其免疫原性的突變體將具有重要價值和意義。基于溶血素結構的分析，其353位點的氨基酸是溶血素溶血活性關鍵位點，構建豬鏈球菌溶血素353位點氨基酸突變的菌株理論上既可以保持其高的免疫效力，也可以降低其致病性。作為弱毒疫苗菌株時可保障更好的安全性；作為滅活疫苗菌株時也可避免毒素的副作用，一方面可提高免疫菌量增強免疫效力，另一方面可減少免疫的副反應提高安全性。

由于，豬鏈球菌是目前危害養豬業的第一大細菌性傳染病，同時也是一種非常重要的人獸共患病。疫苗免疫是防控該病的重要策略，但是現有疫苗通常只針對特定血清型，而對其它血清型無效。因此，開發一種預防多種血清型豬鏈球菌感染的疫苗一直是該病防控技術研究的重大需求。正因如此，全球許多國家的獸醫學實驗室采用了多種策略來研制這種對多種血清型感染有效的疫苗。包括：基因工程亞單位疫苗、傳代致弱的弱毒疫苗、以及分離的弱毒株開發的弱毒疫苗。雖然取得了一定的效果，但實際應用時卻受到成本太高、免疫效力低等諸多限制以及毒力返強的風險。

發明內容