[發明專利]豬鏈球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌及在疫苗中應用

有效

• 申請號: 201810076108.7
• 申請日: 2018-01-26
• 公開（公告）號: CN108410784B
• 公開（公告）日: 2021-07-27
• 發明（設計）人: 張安定;徐磊;林嵐;呂偉華;韓麗
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12N1/21
• 分類號: C12N1/21;C12N15/74;A61K39/09;A61P31/04;C12R1/46
• 代理公司: 武漢開元知識產權代理有限公司 42104
• 代理人: 王和平;馮超

1.一種豬鏈球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌，其特征在于：所述菌株命名為streptococcus suis type 2△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，簡稱為：△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，其保藏編號為：CCTCC NO：M2016584；所述豬鏈球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌由以下方法制備而成：

1)以豬鏈球菌2型05ZYH33株全基因組為模板，設計敲除cpsEF基因和ssna基因的引物、以及構建sly基因點突變的引物對，

其中，敲除cpsEF基因引物包括cpsEF上游同源臂正反向引物對和下游同源臂正反向引物對；

敲除ssna基因的引物包括ssna上游同源臂正反向引物對和下游同源臂正反向引物對；

構建sly基因點突變的引物對包括ssna上游同源臂正反向引物對和下游同源臂正反向引物對，以及353位點點突變的引物；其中，

a.構建敲除cpsEF基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

ECORI-E-1：AAAGAATTCGGCTCGTGCTATATTCTCTTGG，

RONGHE-EF-2：GAATCTTTTTCATAACAGCTCCTCCACTATTTC；

下游同源臂正反向引物：

RONGHE-EF-1：GAAATAGTGGAGGAGCTGTTATGAAAAAGATTC，

BAMHI-F-2：AAAGAATCCGGTTTGCCACAGCCTGTG；

b.構建敲除ssna基因的引物：

上游同源臂正反向引物：

DSsnA-LF1:GGCGAATTCTGTTCGCATCAGTCGTAG，

DSsnA-LR1:GAACCAGGGCGTATCTCTTCATATAAAACTCCTTTTTGTTAT；

下游同源臂正反向引物：

Dssna-RL1:GAAAGATCGCCGTGTAATCATTTTTTGAGCTTGAAAGCATGAC，

Dssna-RR1:CGAGGATCCCAATTTCAACCTCGGTCGCTC；

c.構建SLY基因點突變的引物

上游同源臂正反向引物：

SLY-SacI-L1：ACCATTAGAGCTCAATTTTGATGCCGTG，

SLY(P353L)-R1：

TCTCCACCACTCAAATAAATTGAGTTTTCCG；

下游同源臂正反向引物：

SLY(P353L)-L2：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-BamHI-R2：

GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；

353位點點突變的引物：

SLY-P353L-L：GATACGGAAAACTCAATTTAGGTGTTC，

SLY-P353L-R：

GAATACGAAATCGGAACACCTAAATTGAGTTTTC；

2)從豬鏈球菌2型野生菌株SC19中提取細菌基因組；

3)以細菌基因組為模板，用上述cpsEF上游同源臂正反向引物對和下游同源臂正反向引物對進行PCR，純化回收得到上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物，將上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物進行融合PCR，得到融合產物cpsEF-LR；

4)用EcoRI和BamHI將融合產物cpsEF-LR和載體pSET4s分別進行雙酶切，并將產物cpsEF-LR和線性化的載體pSET4s連接，得到重組質粒pSET4s-cpsEF；

5)將豬鏈球菌2型菌株SC-19制作電轉感受態細胞，將重組質粒pSET4s-cpsEF加入到SC-19感受態細胞中進行電轉，復蘇后涂布TSA平板上培養，得到單菌落；鑒定該菌落并命名為缺失突變體△cps-SC19；

6)以細菌基因組為模板，用上述ssna上游同源臂正反向引物對和下游同源臂正反向引物對進行PCR，純化回收得到上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物，將上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物進行融合PCR，得到融合產物ssna-LR；

7)用EcoRI和BamHI將融合產物ssna-LR和載體pSET4s分別進行雙酶切，并將產物ssna-LR和線性化的載體pSET4s連接，得到重組質粒pSET4s-ssna；

8)將cps基因敲除的突變菌株△cps-SC19制作電轉感受態細胞，將重組質粒pSET4s-ssna加入到△cps-SC19感受態細胞中進行電轉，復蘇后涂布平板上培養，得到單菌落；鑒定該菌落并命名為缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19；

9)以細菌基因組為模板，用sly上游同源臂正反向引物對和下游同源臂正反向引物對進行PCR，純化回收得到上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物，將上游同源臂PCR產物和下游同源臂PCR產物進行融合PCR，得到融合產物sly-del353；應用sly上游同源臂的正向引物SLY-SacI-L1和下游同源臂的反向引物SLY-BamHI-R2擴增sly全長基因片段；

10)用SacI和BamHI將融合產物sly-del353、sly全長基因片段和載體pSET4s分別進行雙酶切，得到線性化的融合產物sly-del353、線性化的基因組全長基因片段sly和線性化的載體pSET4s；將線性化的融合產物sly-del353和線性化的基因組全長基因片段sly分別與線性化的載體pSET4s連接，得到兩個重組質粒，命名為pSET4s-sly-del353和pSET4s-sly-LR；再以pSET4s-sly-LR為模板，用353位點點突變的引物對進行PCR，得到質粒pSET4s-sly；

11)將豬鏈球菌缺失ssna和cps的菌株△cps/ssna-SC19制作電轉感受態細胞，將重組質粒pSET4s-sly-del353加入到△cps/ssna-SC19感受態細胞中進行電轉，復蘇后涂布得到平板上培養，得到單菌落；鑒定該菌落并命名為缺失突變體△sly/cps/ssna-SC19；

12)將缺失突變體△sly/cps/ssna-SC19制作電轉感受態細胞，將pSET4s-sly質粒電轉到感受態細胞中，利用溫度和抗性誘導質粒和細菌基因組發生重組交換，利用SLY-SacI-L1、SLY-BamHI-R2引物進行PCR擴增，能擴增得到且僅有一條1200bp條帶的菌株，為篩選得到正確的菌株，命名為豬鏈球菌cps和ssna基因敲除以及溶血素基因定點突變菌株streptococcus suis△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19，即豬鏈球菌△CPS/SsnA-mSly(P353L)-SC19工程菌。