[發明專利]用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法

在審

• 申請號: 201810075725.5
• 申請日: 2018-01-26
• 公開（公告）號: CN108444956A
• 公開（公告）日: 2018-08-24
• 發明（設計）人: 金海如;蔣湘艷
• 申請（專利權）人: 浙江師范大學
• 主分類號: G01N21/64
• 分類號: G01N21/64
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 沈淵琪

本發明涉及用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法。其包括以下步驟：AM真菌與共生植物根系建立共生體；利用熒光染料溶液處理AM真菌根組織，分段后置于載玻片上，并用蓋玻片封片；利用激光共聚焦顯微鏡觀察收集圖像及進行圖像處理。通過本發明可以靈敏的分析觀察和判斷AM真菌和其他侵染植物是否建立共生關系，可以作為鑒定AM真菌是否與植物共生的靈敏方法；通過本發明易于三維立體觀察和分析根系菌根叢枝結構的發育；根據觀察到的菌根真菌叢枝結構在植物根部的分布情況，可以用本發明同時研究與叢枝結構對應的植物根細胞質膜的膨大部分，叫做圍叢枝膜的生物學功能，如營養物質氮﹑磷輸運蛋白基因在膜上表達的比較研究。

技術領域

本發明具體涉及用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法。

背景技術

菌根是植物根系和菌根真菌形成的共生體，自然界中的菌根分為外生菌根和內生菌根。叢枝菌根(Arbuscular Mycorrhizal，AM)真菌是自然界中普遍存在的一類內生菌根真菌，地球上約90%的維管束植物都能與其形成叢枝菌根。AM真菌與宿主植物互惠共生：真菌的根外菌絲體（Extraradical Mycelium,ERM）從土壤中吸收磷、氮素及其它營養元素供給宿主植物，改善了植物對礦質元素的吸收能力，促進植物生長，增強植物的抗逆性等，宿主植物則供給真菌生長所必需的碳水產物。AM真菌的結構主要分為叢枝、菌絲和孢子，除了巨孢囊霉屬和盾孢囊霉屬以外大多數AM真菌還具有泡囊結構。叢枝是AM真菌繁殖體侵染植物根的根內菌絲，菌絲在皮層細胞內不斷分叉分枝形成的枝狀結構（arbuscule）；與之對應的是植物根細胞質膜的膨大部分，叫做圍叢枝膜（PAM，periarbuscular membrane）。圍叢枝膜以及與叢枝結構包圍的間隙叫做圍叢枝空間（PAS，periarbuscular space），圍叢枝空間PAS是真菌與植物共生體進行營養與信息交換的主要場所。

隨著AM真菌叢枝結構的形成，根部皮層細胞發生巨大變化，這需要重新組織細胞質膜，包括細胞骨架和細胞器的重構，尤其是膜面積的巨大增加。其中有些細胞的改變已經用以前傳統的抗體和熒光蛋白融合標記技術檢測，但是這些菌根侵染細胞仍有很多生物學方面的功能是目前傳統技術研究不清楚的。

此外，由于傳統的光學顯微鏡只能觀察染色后的叢枝狀結構，而且只能是一個平面上的物像，所以不能全面觀察了解叢枝狀結構，影響了對其生物功能的進一步研究和了解。于是迫切需要一種能夠三維立體、多角度觀察的顯微方法。

發明內容

針對現有技術存在的問題，本發明的目的在于設計提供一種用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法的技術方案。

所述的用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法，其特征在于包括以下步驟：

1）AM真菌與共生植物根系建立共生體；

2）利用熒光染料WGA-Alexa fluor488 溶液處理AM真菌根組織，分段后置于載玻片上，并用蓋玻片封片；

3）利用激光共聚焦顯微鏡觀察收集圖像及進行圖像處理。

所述的用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法，其特征在于所述的步驟1）具體為：將生根3個星期的共生植物，從MS瓊脂培養基中取出，轉移到含有MS培養基的培養皿上，同時接種上與胡蘿卜根侵染的叢枝菌根真菌孢子或菌絲，進行共生培養。

所述的用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法，其特征在于所述的步驟2）具體為：

a、將步驟1）得到的AM真菌侵染的植物根浸泡于50%乙醇1小時；

b、用水清洗后，放入20%KOH溶液中90℃保溫2小時，再分別用蒸餾水和PBS緩沖溶液洗滌；