[發明專利]用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法在審
| 申請號： | 201810075725.5 | 申請日： | 2018-01-26 |
| 公開（公告）號： | CN108444956A | 公開（公告）日： | 2018-08-24 |
| 發明（設計）人： | 金海如;蔣湘艷 | 申請（專利權）人： | 浙江師范大學 |
| 主分類號： | G01N21/64 | 分類號： | G01N21/64 |
| 代理公司： | 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213 | 代理人： | 沈淵琪 |
| 地址： | 321004 浙*** | 國省代碼： | 浙江;33 |
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| 摘要： | |||
| 搜索關鍵詞： | 激光共聚焦顯微鏡 觀察 熒光染料 靈敏 熒光染料溶液 生物學功能 蛋白基因 共生關系 菌根真菌 侵染植物 三維立體 圖像處理 細胞質膜 營養物質 植物根部 植物根系 蓋玻片 根組織 共生體 載玻片 植物根 封片 根系 菌根 膨大 輸運 分段 共生 并用 分析 發育 圖像 研究 | ||
1.用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法，其特征在于包括以下步驟：
1）AM真菌與共生植物根系建立共生體；
2）利用熒光染料WGA-Alexa fluor488 溶液處理AM真菌根組織，分段后置于載玻片上，并用蓋玻片封片；
3）利用激光共聚焦顯微鏡觀察收集圖像及進行圖像處理。
2.如權利要求1所述的用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法，其特征在于所述的步驟1）具體為：將生根3個星期的共生植物，從MS瓊脂培養基中取出，轉移到含有MS培養基的培養皿上，同時接種上與胡蘿卜根侵染的叢枝菌根真菌孢子或菌絲，進行共生培養。
3.如權利要求1所述的用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法，其特征在于所述的步驟2）具體為：
a、將步驟1）得到的AM真菌侵染的植物根浸泡于50%乙醇1小時；
b、用水清洗后，放入20%KOH溶液中90℃保溫2小時，再分別用蒸餾水和PBS緩沖溶液洗滌；
c、將洗滌后的AM真菌侵染的植物根培養在含有濃度為5ug/ml的WGA-Alexa fluor488溶液的培養皿中過夜；
d、把含有WGA-Alexa fluor488的根切成4毫米長的片段，再把4毫米根段組織放置于厚度在0.8～1.2mm之間載玻片上，用厚度在0.17mm蓋玻片封片。
4.如權利要求1所述的用激光共聚焦顯微鏡和熒光染料觀察AM真菌叢枝結構的方法，其特征在于所述的步驟3）具體為：根片段用Leica TCS-SP5共聚焦顯微鏡用20倍或63倍水浸式目鏡觀察成像，同時根據熒光收集不同干擾比對圖像DIC，激光488nm，photo counting610，掃描時間35.18秒，Pixel Dwell 38.49秒,Pixel size 0.21um，Frame mode，掃描區域圖像大小139.3×104.6um，光學截圖用0.08um 間隔收集并疊加，圖像用Leica LAS-AF軟件2.6.0處理。
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