[發明專利]一種遺傳分析儀測試專用等位基因標準對照試劑制備方法

在審

• 申請號: 201810075586.6
• 申請日: 2018-01-26
• 公開（公告）號: CN108085367A
• 公開（公告）日: 2018-05-29
• 發明（設計）人: 姜伯瑋;榮海博;管樺;張濤;金川
• 申請（專利權）人: 公安部第一研究所;北京中盾安民分析技術有限公司
• 主分類號: C12Q1/6811
• 分類號: C12Q1/6811
• 代理公司: 北京科億知識產權代理事務所(普通合伙) 11350
• 代理人: 湯東鳳

1.一種遺傳分析儀測試專用等位基因標準對照試劑制備方法，其特征在于，包括如下步驟：

S1進行大量群體樣本的采集，獲得設定數量人群的血液或唾液樣本；

S2對步驟S1中采集得到的全體樣本進行STR分型檢測，確定每個樣本的STR分型；

S3根據步驟S2中得到的STR分型結果挑選包含相應分型等位基因的樣本；

S4等位基因克隆庫的建立：在步驟S3所挑選得到的樣本中，對于等位基因齊全的基因座采用直接克隆的方式獲得全部等位基因的克隆，對于等位基因不全的位點采取先克隆后定點突變的方法進行等位基因克隆庫的建立；

S5等位基因克隆庫建立后，開始熒光標準物的制備：首先設計、合成篩選出相應位點的特異性熒光引物，系列稀釋所選取的質粒DNA，并進行熒光PCR擴增以摸索質粒DNA的最適濃度，之后進行模板混合調平，確定各質粒DNA的濃度后，進行多模板熒光復合PCR擴增并檢測，經檢驗后進行純化并分裝保存。

2.根據權利要求1所述的遺傳分析儀測試專用等位基因標準對照試劑制備方法，其特征在于，步驟S4中，所述對于等位基因齊全的基因座采用直接克隆的方式獲得全部等位基因的克隆，具體過程如下：

4.1.1)設計引物對篩選出的純合子進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，染色，產物膠回收純化后將其插入質粒載體中；

4.1.2)將重組質粒導入大腸桿菌，培養大腸桿菌，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝；

4.1.3)測序并篩選序列正確的陽性克隆并用質粒通用引物對重組質粒進行DNA測序分析，證實插入片段的序列信息，按重復單位的重復次數對插入的等位基因片段進行分類，建立包含不同長度的等位基因克隆庫。

3.根據權利要求1所述的遺傳分析儀測試專用等位基因標準對照試劑制備方法，其特征在于，步驟S4中，所述對于等位基因不全的位點采取先克隆后定點突變的方法進行等位基因克隆庫的建立，具體過程如下：

4.2.1)設計克隆引物對挑選出的分型樣本進行PCR擴增，擴增產物進行瓊脂糖凝膠電泳分離，染色，產物膠回收純化后將其插入質粒載體中；

4.2.2)將重組質粒導入大腸桿菌，培養大腸桿菌，從而獲得單一DNA分子的大量拷貝；

4.2.3)測序并篩選序列正確的陽性克隆并用質粒通用引物對重組質粒進行DNA測序，分析證實插入片段的序列信息，按重復單位的重復次數對插入的等位基因片段進行分類，然后采用核心序列定點突變技術，獲得一系列指定核心序列重復次數的不同等位基因克隆，繼而建立該位點全部等位基因克隆庫。

4.根據權利要求1所述的遺傳分析儀測試專用等位基因標準對照試劑制備方法，其特征在于，步驟S5中，所述進行熒光PCR擴增以摸索質粒DNA最適濃度的具體流程為：

采用0.2uM所述特異性熒光引物對不同濃度的質粒DNA進行擴增，采用遺傳分析儀對擴增產物進行檢測，采用genemapper軟件進行分析，所述質粒DNA的最適濃度應當滿足所獲得的分型圖譜中的峰的相對熒光強度即RFU值保持在2000-9000以內，并且峰型尖銳，沒有無法根據峰高值判斷模板濃度的現象出現。