[發明專利]一種鮑魚血細胞處理方法

有效

• 申請號: 201810075334.3
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108396008B
• 公開（公告）日: 2021-03-23
• 發明（設計）人: 李明珠;楊熙蕓;孔瑤瑤;李圣強;時心澤;畢秀娟;潘世杰;姚傳偉;李浩宇;孟曉雪;劉明芳;阮澤立
• 申請（專利權）人: 魯東大學
• 主分類號: C12N5/078
• 分類號: C12N5/078
• 代理公司: 北京中濟緯天專利代理有限公司 11429
• 代理人: 楊樂

本發明公開了一種鮑魚血細胞處理方法，首先在2ml離心管中加入1ml抗凝保護劑；然后用解剖刀劃開鮑魚腹足部血竇，將鮑魚傾斜20?30°放在冰上以便血液更易流出；待血液流出，用無菌注射器抽1ml血直接注入到加入抗凝保護劑后的離心管中；用一種用于流式細胞儀檢測的血液過濾器過濾血液到新的2ml離心管中；再經18℃，3000rpm離心10min，去掉上清；最后用1ml濾菌海水重新懸浮血細胞制成鮑血淋巴懸液。該方法通過采用合適的血液抗凝保護劑和血液過濾器，能夠有效的延長血細胞的凝集時間，快速過濾血液中的雜質，改善血液的純度，減少實驗誤差，使實驗結果更加準確。

技術領域

本發明涉及鮑魚血細胞處理技術領域，具體涉及一種鮑魚血細胞處理方法。

背景技術

鮑魚由于營養豐富，經濟價值高，成為我國重要的海水養殖品種。目前，在生物實驗領域，并沒有一種完全針對鮑魚血細胞的統一處理方式。人們通常采用各種不同的方式來處理鮑魚的血細胞。在不加抗凝保護劑的情況下，鮑魚血細胞一旦離體，幾分鐘內即大量凝集。即便加入某些抗凝保護劑的鮑魚血細胞也會在短時間內大量死亡。這樣不僅要求實驗在短時間內就要完成，還會導致實驗結果受系統誤差影響較大、實驗成本增加，實驗結果不準確等問題。因此快速處理血細胞，確保在一定時間內鮑魚血細胞不凝集在實驗中十分重要。

目前，用于流式細胞儀檢測的貝類(鮑魚)血液，并沒有一套完整或正規的處理裝置，人們一般將收集到的血液不經過濾處理就直接進行流式細胞儀檢測。結果表明，沒有經過處理的血液含有較多雜質，呈現出來的圖像是一個比較混亂、雜亂無章的散點圖。另外，未處理細胞群容易造成檢測儀堵塞，需要花很長的時間對檢測儀進行清洗(10-40min)，才能繼續進行測樣。這樣不僅耽誤檢測的進程，也無形間造成測試費用升高(200元/h)。所以在鮑魚血細胞處理過程中采用合適的血液過濾器也十分必要。

發明內容

本發明的目的在于提供鮑魚血細胞處理方法，通過采用合適的血液抗凝保護劑和血液過濾器，能夠有效的延長血細胞的凝集時間，快速過濾血液中的雜質，改善血液的純度，減少實驗誤差，使實驗結果更加準確。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種鮑魚血細胞處理方法，其特征在于，所述處理方法包括如下步驟：

(1)首先在2ml離心管中加入1ml抗凝保護劑；

(2)然后用解剖刀劃開鮑魚腹足部血竇，將鮑魚傾斜20-30°放在冰上以便血液更易流出；

(3)待血液流出，用無菌注射器抽1ml血直接注入到加入抗凝保護劑后的離心管中；

(4)用一種用于流式細胞儀檢測的血液過濾器過濾步驟(3)中液體到新的2ml離心管中；

(5)再經18℃，3000rpm離心10min，去掉上清；

(6)最后用1ml濾菌海水重新懸浮經過步驟(5)處理的血細胞制成鮑血淋巴懸液。

上述鮑魚血細胞處理方法中，所述抗凝保護劑由以下成分組成：氯化鈉2.45～2.55g、EDTA0.9～1.1g、1，4-哌嗪二乙磺酸0.22～0.24g和0.1mM PBS 100ml。

優選地，所述抗凝保護劑由以下成分組成：氯化鈉2.5g、EDTA 1g、 1，4-哌嗪二乙磺酸0.23g和0.1mM PBS 100ml。

上述鮑魚血細胞處理方法中，所述抗凝保護劑的制備方法為：

(1)將0.1mM PBS緩沖液倒入燒杯中，再向燒杯中加入固體氯化鈉粉末攪拌3-5分鐘，直到氯化鈉全部溶解，然后再加入1，4-哌嗪二乙磺酸粉末充分攪拌溶解得混合溶液A；

(2)將混合溶液A放入38-40℃水浴鍋中加熱，再緩慢加入EDTA，邊加入邊攪拌，直到EDTA完全溶解得混合溶液B；