[發明專利]一種靶向結腸癌的重組蛋白及其制備方法和用途

在審

• 申請號: 201810075231.7
• 申請日: 2018-01-25
• 公開（公告）號: CN108047335A
• 公開（公告）日: 2018-05-18
• 發明（設計）人: 柳增善;張嵩;王海波;李萌;胡盼;任洪林;盧士英;常江;史永亮
• 申請（專利權）人: 上海杵焱健康科技有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C07K1/36;C07K1/30;C07K1/20;C07K1/18;C07K1/16;C12N15/62;C12N15/70;A61K38/16;A61K47/42;A61P35/00
• 代理公司: 吉林長春新紀元專利代理有限責任公司 22100
• 代理人: 魏征驥

本發明涉及一種靶向結腸癌的重組蛋白及其制備方法和用途，屬于基因工程領域。一種靶向結腸癌的重組蛋白，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所述，純化方法包含了硫酸銨沉淀法、疏水層析、離子交換層析和分子排阻層析，均是以蛋白質的理化性質分離蛋白的溫和方法，避免了使用親和層析類等較為劇烈的純化方式，在滿足純度的同時，減少了蛋白活性的損失。純化后的靶向結腸癌的重組蛋白經細胞水平和動物實體瘤水平試驗證實，其具有顯著的抗腫瘤活性，為結腸癌的個體化治療提供了新的方向。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，尤其是指靶向結腸癌的重組蛋白及其制備方法和用途。

背景技術

結腸癌(Colorectal cancer,CRC)是人類高發惡性腫瘤之一，其發病率一直呈上升趨勢，全球每年患結腸癌的病例超過1億人，在全球惡性腫瘤發病率中已上升至第三位，其死亡率居惡性腫瘤死因的第二位。在我國，結腸癌的發病率和死亡率均保持上升趨勢，其發病遞增速度為世界平均數的兩倍，已位于我國惡性腫瘤發病率的第四位，嚴重危害人類健康。目前，結腸癌的治療手段以手術治療為主，輔以全身或局部化療、放療等治療手段，但術后腫瘤易復發，且化療、放療毒副作用大，易引起腫瘤細胞耐藥。40年前，Moolten FL等提出的重組毒素概念為癌癥的診療帶來一片光明。重組毒素的策略是基于抗原-抗體、激素-受體特異性結合的特性，以腫瘤細胞表面特有的標志物、特異受體或高表達的受體為靶標，使毒素集中于腫瘤細胞周圍，最終將腫瘤細胞殺死而對正常細胞無損害。近年來，隨著基因工程技術的發展，利用基因重組技術將負責細胞識別的抗體片段或激素基因與毒素活性片段的基因進行融合，經表達及純化制備得到新型重組毒素。新型重組毒素具有靶向性好、殺傷能力強、毒性低、分子量小、免疫原性低、產生的分子均一、成本低易于改造、能夠大量生產等優點，具有良好的開發應用前景。

近年來，諸多國內外學者開展大量涉及胃腸道腫瘤生長、侵襲、轉移等發病機制或信號傳導通路的研究。隨著研究的深入，人們發現胃腸道腫瘤細胞表達的膽囊收縮素受體(Cholecystokinin receptor,CCKR)可通過自分泌或旁分泌途徑促進腫瘤細胞的增生和轉移，即腫瘤細胞既合成分泌膽囊收縮素(Cho1ecystokinin,CCK)和胃泌素(Gastrin,GS)，又表達CCKR，前者作為生長因子與分泌CCK和GS的細胞或周圍細胞表面的CCKR結合，產生增殖信號傳入核內，引起腫瘤細胞生長，尤其是2型膽囊收縮素受體(CCK2R)在大多胃癌、結直腸癌細胞及癌旁組織細胞膜上高表達，而正常組織表達量極低，與結腸癌的發生發展過程有密切關系，是結直腸癌診斷和治療的理想靶點。

膽囊收縮素(Cholecystokinin，CCK)是十二指腸及近端空腸離散的腸內分泌細胞(I型)和大腦神經元合成分泌的，其主要的生理學作用是刺激胰腺分泌、膽囊收縮、產能、抑制胃酸分泌、腸能動性、促進細胞生長、基因表達、蛋白合成和飽腹感等。另外，CCK也能夠促進外分泌性胰腺的生長，大量實驗證實，CCK與動物的進食、記憶、疼痛、焦慮等精神狀態有關。CCK在人體內以多種長短不同的分子形式存在，均由含115個氨基酸殘基的CCK原加工剪切形成的多肽，包括CCK-83、CCK-58、CCK-39、CCK-33、CCK-25、CCK-22、CCK-18、CCK-12、CCK-8、CCK-7、CCK-6、CCK-5以及CCK-4。

綠膿桿菌外毒素(Pseudomonas Exotoxin,PE)是制備重組毒素的理想毒素分子，其高效殺傷活性及細胞殺傷機制已得到詳細闡明。對PE分子進行加工修飾，并與人工靶向元件(如受體配基和抗體片段)結合，使其發揮細胞毒性潛能，可選擇性消除某些特異性腫瘤細胞。Ira Pastan等證明一個毒素分子在35min內可成功的失活300個核糖體，理論上一個重組毒素分子與腫瘤細胞結合后即可將該細胞殺死，但由于毒素內化效率、細胞內Furin酶切割效率的影響(Furin酶對PE的切割效率為5％-15％)，殺死一個腫瘤細胞需要400-1000個毒素分子。這要求在殺死靶細胞時需要一定量的毒素分子，確保了少量非特異性結合至正常細胞表面的毒素不能發揮細胞毒作用，從而保證了對正常細胞的安全性，因此在抗癌藥物的應用中具有很高的價值。